木薯栽培種ZM-Seaside和花葉變種塊根蛋白組學分析

宋雁超 安飛飛 薛晶晶 秦于玲 李開綿 陳松筆

（1. 海南大學農學院，海口570228；2. 中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所 農業(yè)部木薯種質資源保護與利用重點實驗室，儋州 571737）

木薯栽培種ZM-Seaside和花葉變種塊根蛋白組學分析

宋雁超1，2安飛飛2薛晶晶2秦于玲2李開綿2陳松筆2

（1. 海南大學農學院，海口570228；2. 中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所 農業(yè)部木薯種質資源保護與利用重點實驗室，儋州 571737）

為研究木薯栽培種ZM-Seaside（高產(chǎn)種質）和花葉變種（低產(chǎn)種質）塊根產(chǎn)量差異的原因，從農藝性狀和蛋白質組學角度對以上2個種質進行分析，為選育高產(chǎn)木薯品種提供理論依據(jù)。試驗中采用旋光法測定淀粉含量；硝酸銀滴定法測定氫氰酸含量；苯酚抽提法提取蛋白質；雙向電泳技術分離蛋白質；Delta2D軟件確定差異蛋白質點；質譜技術鑒定差異蛋白質點，結合KEGG數(shù)據(jù)庫將其功能分類；利用Western blot技術對部分差異蛋白質進行驗證；String在線軟件構建蛋白質互作調控網(wǎng)絡。結果顯示，ZM-Seaside塊根淀粉含量為29.18%，顯著高于花葉變種的25.83%；兩種木薯鮮薯薯肉氫氰酸含量均低于50 mg/kg，屬可食用木薯種質。ZM-Seaside干物率為40.28%，顯著高于花葉變種的37.16%。以花葉變種塊根的全蛋白質為對照，ZM-Seaside的塊根存在39個差異蛋白質點，其中上調表達23個，下調表達16個；經(jīng)質譜技術成功鑒定到其中28個，其功能涉及到碳水化合物和能量代謝（7個）、分子伴侶（8個）、解毒和抗氧化（2個）、蛋白質合成（1個）、結構蛋白（3個）及未知功能蛋白質（7個）。STRING代謝網(wǎng)絡顯示：熱激蛋白Heat shock protein和分子伴侶Molecular chaperone Hsp90-1互作關系最多，是整個互作調控網(wǎng)絡的樞紐。推測這2個蛋白質是影響ZM-Seaside和花葉變種塊根產(chǎn)量差異的關鍵蛋白質，這些蛋白質有可能成為選育高產(chǎn)木薯種質的標記蛋白質。

木薯栽培種；花葉變種；塊根；農藝性狀；蛋白質組

木薯（Manihot esculenta Crantz）是世界上重要的糧食作物，塊根可為非洲、亞洲以及中美洲提供糧食安全保障［1］。木薯較其它作物的優(yōu)勢為產(chǎn)量高，抗旱能力強［2］。在熱帶地區(qū)，木薯是繼水稻和玉米之后重要的膳食來源，是全世界8億人的主要食物來源［3］。2014年我國木薯種植面積為38萬hm2，鮮薯總產(chǎn)量約780萬t；單產(chǎn)約20 t/hm2，離木薯理論產(chǎn)量的90 t/hm2還有很大的增長空間。因此研究影響木薯產(chǎn)量的因素，為進一步提高我國木薯單產(chǎn)提供理論依據(jù)是必要的。

木薯基因組高度雜合，后代性狀分離嚴重，還具有自交不親和、種子數(shù)量少等特性，導致雜交選育種效率低，這些特性已經(jīng)嚴重阻礙木薯選育高產(chǎn)品種的進程［4］。目前僅依靠傳統(tǒng)的雜交育種手段很難快速提高木薯的選育種周期，近年來利用高通量測序技術開展野生木薯近緣種M. esculenta ssp. flabellifolia（W14）與栽培品種M. esculenta ssp. esculenta（KU50）比較基因組學研究，完成了W14和KU50 的全基因組草圖，注釋了碳流、淀粉積累和氫氰酸合成代謝通路關鍵基因的生物學功能，并成功開發(fā)出數(shù)百萬個全基因組分子標記［5］，為選育種提供全基因組的平臺。但通過全基因組數(shù)據(jù)只能間接推測蛋白質的功能，因為從基因表達的mRNA水平到最終合成蛋白質水平，其中包含著蛋白質翻譯的調控、糖基化、磷酸化等諸多因素，這些因素都有可能改變作為直接作用因子的蛋白質功能，因而直接研究蛋白質變化具有不可替代的意義［4］。

目前對木薯全蛋白質水平的研究還很不全面，因此本研究選用木薯高產(chǎn)栽培種ZM-Seaside和低產(chǎn)種質花葉變種作為研究材料，從全蛋白質的角度揭示這兩個種質塊根產(chǎn)量差異的主要原因，挖掘影響木薯產(chǎn)量的關鍵蛋白質，為選育高產(chǎn)木薯品種提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗研究材料木薯高產(chǎn)栽培種質ZM-Seaside和低產(chǎn)種質花葉變種均來自中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所木薯種質資源圃［6］。以種植10個月后收獲的木薯塊根作為研究對象。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)量的測定 種植后10個月，測定花葉變種和木薯栽培種ZM-Seaside的單株鮮薯重。每個品種選取15株。

1.2.2 木薯塊根淀粉含量的測定 淀粉測定采用旋光法［7］；應用W ZZ- 1型旋光儀測定旋光物的旋光度。按照公式SC=（a×100）×100/（L×203×m）計算木薯的淀粉含量，式中SC為鮮薯粗淀粉含量（%），a為旋光度讀數(shù)（度），L為觀測管長度（2 dm），m為樣品質量（g），203為淀粉的比旋光度。

1.2.3 木薯塊根氫氰酸含量的測定 氫氰酸含量的測定采用硝酸銀滴定法［8］。使木薯浸水過夜發(fā)酵析出氫氰酸，然后將此溶液通入蒸汽蒸餾出氫氰酸，用過量的硝酸銀標準溶液吸收蒸餾出來的氫氰酸，最后以標定好的硫氰化鉀滴定多余的硝酸銀溶液；由硝酸銀用量與剩余硝酸銀之差即可算出樣品中氫氰酸（HCN）含量。

式中，V1為用硫氰化鉀滴定25 mL硝酸銀時消耗的體積（mL）；V2為滴定剩余硝酸銀時消耗的體積（mL）；c為標準硫氰酸鉀的濃度（mol/L）；27為氫氰酸的摩爾質量（g/mol）；m為木薯樣品質量（g）。

1.2.4 木薯塊根干物質率的測定 根據(jù)國際熱帶農業(yè)科學院中心制定的公式計算干物率［9］。取一定質量的鮮薯于燒杯中，放在60℃干燥箱里烘干，大約4-5 d后每天測定重量直至衡重，記錄衡重時木薯的重量。干物率=薯干重/鮮薯重

1.2.5 木薯塊根蛋白質表達水平的分析 利用Western blot方法［10］對3種與淀粉積累相關的蛋白質UGPase（購自Agrisera公司，貨號AS05086，分子量：51.6 kD）、AGPase（購自Agrisera公司，貨號AS111739，分子量：49.4 kD）和SPS（購自Agrisera公司，貨號AS03035A，分子量：120-130 kD）進行表達水平分析，用Actin（購自Agrisera公司，貨號AS132640，分子量：45kD）作為對照。利用ChemiImager 4400軟件計算蛋白質的相對表達含量。

1.2.6 木薯塊根全蛋白質的提取、分離和鑒定 木薯ZM-Seaside和花葉變種塊根全蛋白質的提取均采用Chen等［11］苯酚提取法，溶解后用Bradford試劑盒進行定量，后參照Chen等［11］雙向電泳技術將蛋白質進行分離。以花葉變種塊根全蛋白質圖譜為對照，采用Delta2D軟件確定ZM-Seaside塊根的差異蛋白質點，對平均差異表達量在±2.0以上的蛋白質進行標記［12］。蛋白質的鑒定參照An等［2］方法。本研究設3個生物學重復進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.2.7 木薯蛋白質互作網(wǎng)絡構建 采用String軟件對鑒定出的差異蛋白質構建蛋白質互作網(wǎng)絡［13］。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學分析采用 Excel 2010和DPS v7.55 軟件，差異顯著性分析采用新復極差法（Duncan）［14，15］。

2 結果

2.1 木薯塊根氫氰酸含量、淀粉含量及干物率

將花葉變種以及ZM-Seaside塊根的薯肉跟薯皮分開處理，分別測定它們的氫氰酸含量。結果（圖1）顯示，ZM-Seaside塊根皮中氫氰酸含量（70.09 mg/kg）要高于花葉變種塊根皮（62.61 mg/kg）中的氫氰酸含量，兩種木薯塊根薯肉的氫氰酸含量均較低，且沒有顯著差異。同時由圖1可知木薯氫氰酸主要存在于木薯塊根皮中，根據(jù)NY/T 875 規(guī)定食用木薯鮮薯薯肉中氫氰酸殘留量不能超過50 mg/kg，因此這兩種木薯塊根均可食用。木薯收獲后，測定得到花葉變種粗淀粉含量（25.83%）顯著低于ZMSeaside粗淀粉含量（29.18%）（圖2）；兩種木薯的干物率為分別為37.16%及40.28%，栽培種ZMSeaside的干物率顯著高于花葉變種。由此可知，栽培種ZM-Seaside淀粉含量和干物率均顯著高于花葉變種，進而導致其產(chǎn)量顯著高于花葉變種。

圖1 花葉變種和栽培種ZM-Seaside塊根氫氰酸含量

圖2 木薯花葉變種和栽培種ZM-Seaside塊根產(chǎn)量相關參數(shù)分析

2.2 與淀粉合成相關蛋白質表達分析

本研究利用Western blot方法研究與淀粉積累相關的蛋白質UGPase、AGPase和SPS分別在花葉變種和ZM-Seaside塊根的表達水平（圖3）。將Western blot中每一種蛋白質在兩個木薯種質中的總量定為100%，計算同一種蛋白質在兩個木薯種質間的相對表達量。同時以Actin作為對照，確保兩個木薯種質塊根的上樣量一致（圖3-A）。研究結果表明ZM-Seaside塊根UGPase（圖3-B）、SPS（圖3-C）和AGPase（圖3-D）的表達水平顯著高于花葉變種（P＜0.05）。該研究結果與木薯塊根產(chǎn)量分析結果相一致，因而從與淀粉積累相關蛋白質水平進一步驗證2種木薯塊根產(chǎn)量的差異。

圖3 Actin（A）、UGPase（B）、SPS（C）和AGPase（D）分別在花葉變種及ZM-Seaside塊根中的表達水平分析

2.3 木薯塊根全蛋白的提取、分離和鑒定

通過苯酚沉淀法提取塊根全蛋白質，后經(jīng)定量以及雙向電泳分離、染色后，得到重復性較好的花葉變種及ZM-Seaside塊根蛋白質雙向電泳圖譜（圖4-A和4-B）。以花葉變種為對照，經(jīng)過 Delta 2D軟件分析塊根的電泳圖譜，得到平均差異表達量在 2.0倍［11］以上的蛋白質點39個（圖4-C），包括上調表達23個（黑色箭頭所指），下調表達16個（白色箭頭所指）。通過差異蛋白質點的質譜分析及NCBI數(shù)據(jù)庫搜索比對，成功匹配到其中28個蛋白質（表1）。

2.4 差異蛋白質互作調控網(wǎng)絡的構建

將匹配得到的11個蛋白質通過String在線軟件構建蛋白質互作調控網(wǎng)絡，由圖5可知11個蛋白質節(jié)點共有47種蛋白質互作關系，其中互作最多的蛋白質是Heat shock protein（點2），它同9種蛋白質發(fā)生互作；其次是Molecular chaperone Hsp90-1（點1），含7種蛋白質互作關系，且這兩種蛋白質均下調。再次是Heat-shock protein（點33，上調），含6種蛋白質互作關系，ATP synthase（點10，上調）、Small heat-shock protein（點26，下調）、18.1 kDa class I heat shock protein（點34，上調）均含4種蛋白質互作關系。Protein disulfide-isomerase（點6， 下 調 ） 和Phosphoglycerate kinase，putative-R. communis（點11，上調）含3種蛋白質互作關系。Uroporphyrinogen decarboxylase，putative-R. communis（點15，上調）、Putative inorganic pyrophosphatase-Oryza sativa Japonica Group（點17，下調）、Predicted protein - P. trichocarpa（點19，下調）均有2種互作關系。

圖4 花葉變種（A）及 ZM-Seaside（B）葉片雙向蛋白圖譜及其疊加圖（C）

3 討論

在前期研究中已經(jīng)證明栽培種ZM-Seaside葉片的光合作用要顯著優(yōu)于花葉變種［16］，而ZM-Seaside的塊根產(chǎn)量、淀粉含量干物質率均顯著高于花葉變種。由此可知葉片的光合作用能力能顯著影響木薯塊根的產(chǎn)量。前期也已經(jīng)證明花葉變種葉片中與光合作用相關的蛋白質均下調［16］，而本研究以花葉變種為對照，證明花葉變種塊根中與淀粉積累相關的蛋白點也均下調。UGPase即尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶，1953 年由 Munch-Petersen、Kalckar 和Cutolo在酵母細胞中發(fā)現(xiàn)［17，18］。它催化反應 UTP+葡萄糖-1-P 生成 UDP-葡萄糖+ PPi，而在高等植物中，產(chǎn)物UDPG 被發(fā)現(xiàn)作為主要的葡萄糖基供體參與蔗糖、糖蛋白、纖維素等許多糖類代謝［19］。吳曉俊等［20］早已在黃芪中發(fā)現(xiàn)UGPase 是合成多糖的關鍵酶，在黃芪中總多糖和可溶性多糖積累量均與 UGPase 的活性呈正相關，相關系數(shù)均高于0.9。UGPase 被證明與AGPase 相偶聯(lián)形成 ADPG，參與淀粉的合成［21，22］。而AGPase在植物淀粉合成中作為關鍵的限速酶，催化1-磷酸葡萄糖與ATP作用生成ADPG，為淀粉合成提供葡萄糖基，進而決定作物的產(chǎn)量［23］，因而AGPase控制著淀粉的合成［24］，是影響作物產(chǎn)量的關鍵酶。1955年SPS由Leloir和Cardini在小麥胚芽中發(fā)現(xiàn)［25］。SPS是以 UDPG 為供體，以 6-磷酸果糖（F-6-P）為受體的糖轉移酶，6-磷酸蔗糖在磷酸蔗糖磷酸化酶的作用下脫磷酸并水解形成蔗糖和磷酸根離子［26］。SPS是蔗糖合成過程中的限速酶［27］。蔗糖是高等植物光合作用的主要產(chǎn)物，是碳運輸?shù)闹饕问剑彩恰皫臁贝x的主要基質［28］。Hubbard 等［29］證實網(wǎng)紋甜瓜果實蔗糖積累與 SPS活性上升相關。這3種與產(chǎn)量相關的主要蛋白質在花葉變種中的下調與花葉變種的低產(chǎn)量結果一致。

以花葉變種為對照，比較栽培種ZM-Seaside塊根的全蛋白質變化，成功鑒定出的39個差異蛋白質中，23個上調表達，16個下調表達。同時本研究還利用String在線軟件構建差異蛋白質互作的生物調控網(wǎng)絡，揭示了塊根代謝的調控關系。在整個互作調控網(wǎng)絡中熱激蛋白Heat shock protein和分子伴侶Molecular chaperone Hsp90-1互作關系最多，這2種蛋白質是伴侶蛋白，伴侶蛋白參與到每一個生命活動中，因此伴侶蛋白的互作關系最多。Carvallo等［30］曾報道他在研究類胡蘿卜素的時候發(fā)現(xiàn)具有類胡蘿卜素復合物和缺失類胡蘿卜素復合物的兩個品種中鑒定到大量差異伴侶蛋白。以及呂亞等［31］也曾報道研究木薯葉片與光合作用日變化相關的差異蛋白的時候鑒定到大量伴侶蛋白，指出伴侶蛋白參與到各個生命活動中，在各種生命活動中起輔助作用。輔助作用的伴侶蛋白互作關系較多，其次是能量代謝ATP synthase（點10）互作關系最多。ATP用于能量供應，在栽培種ZM-Seaside塊根中ATP合成酶的上調表明ZM-Seaside塊根整個生命代謝活動旺盛，能量供應充足。因而其產(chǎn)量較花葉變種也高。本研究從蛋白質互作水平揭示了花葉變種塊根產(chǎn)量低于ZM-Seaside的分子機理。這幾個關鍵蛋白質有可能成為篩選木薯高產(chǎn)種質的標記蛋白質。后續(xù)將進一步通過酵母雙雜等技術驗證對這幾個蛋白的互作水平進行驗證。

表1 花葉變種與栽培木薯ZM-Seaside塊根差異蛋白質的鑒定

圖5 差異蛋白質互作網(wǎng)絡的構建

4 結論

本研究通過直接田間測產(chǎn)測定高產(chǎn)種質和低產(chǎn)種質木薯塊根的產(chǎn)量，確定兩種木薯塊根產(chǎn)量有較大差異，進而從全蛋白質水平揭示高產(chǎn)栽培種質ZM-Seaside塊根產(chǎn)量顯著高于低產(chǎn)種質花葉變種的分子機理。通過蛋白質互作調控網(wǎng)絡推測淀粉合成相關蛋白質參與多個代謝途徑，它們使各個代謝通路的蛋白質緊密相連，構成一個相互作用的生物調控網(wǎng)絡。本研究通過蛋白質互作調控網(wǎng)絡篩選出的關鍵蛋白質有可能成為選育豐產(chǎn)木薯品種的標記蛋白質。

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（責任編輯 馬鑫）

Proteomic Analysis on Tuberous Roots of Cassava Cultivar ZMSeaside and Mosaic-leaf Mutation

SONG Yan-chao1，2An Fei-fei2Xue Jing-jing2Qin Yu-ling2Li Kai-mian2CHEN Song-bi2
（1. Hainan University，Haikou 570228；2. Tropical Crops Genetic Resources Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Conservation and Utilization of Cassava Genetic Resources Ministry of Agriculture，Danzhou 571737）

In order to study yield differences between cassava cultivar ZM-Seaside（high yield）and mosaic-leaf mutation（low yield），the tuberous roots were analyzed from the aspects of agronomic traits and proteomics in the present study. The results will provide a theoretical basis for the selection of high yield cassava varieties. Starch content was determined by polarimetry，and the hydrocyanic acid concentration was measured by silver nitrate titration method. Protein extract were performed by phenol extraction and protein was separated using twodimensional electrophoresis. Delta 2D software was used to determine the differentially expressed proteins. The differentially expressed proteins were identified using mass spectrometry in combination with the KEGG database to classify proteins according to their functions. Western blot was used to analyze the protein expression level. String online software was used to construct protein-protein interaction network. Results showed that the starch content of ZM-Seaside（29.18%）was significantly higher than that of mosaic-leaf mutation（25.83%）. Hydrocyanic acid contents of two cassava genotypes in flesh were less than 50 mg/kg，and both of them are in the range of edible cassava. The dry matter rate of ZM-Seaside was 40.28%，significant higher that of mosaic-leaf mutation（37.16%）. 39 differentially expressed protein spots were detected in the tuberous root of ZM-Seaside compared with mosaic-leaf mutation，of which 23 were up-regulated，16 were down-regulated. 28 proteinspots were successfully identified，in which their functions related to carbohydrate and energy metabolism（7），chaperones（8），detoxifying and antioxidant（2），protein biosynthesis（1），structure（3）and function unknown proteins（7）. STRING metabolic network showed that Heat shock protein and Molecular chaperone Hsp90-1 were the hub proteins，which probably are the key of the whole regulatory network. They would be the key proteins affecting the yields between mosaic-leaf mutation and ZM-Seaside，suggesting they may use as the marked proteins to select high-yield cassava varieties.

Cassava cultivar；mosaic-leaf mutation；tuberous root；agronomic traits；proteomics

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.012

2016-07-01

NSFC-CGIAR國際合作重點項目（31361140366），2012年海南省創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才啟動基金項目，國家科技支撐項目（2015BAD15B01）

宋雁超，女，碩士研究生，研究方向：作物分子育種；E-mail：909314893@qq.com

陳松筆，男，研究員，研究方向：木薯分子育種和蛋白質組學；E-mail：songbichen@catas.cn