基于液相色譜串聯質譜的野生型C57BL/6衰老小鼠血清代謝物輪廓分析

郝曉偉 盧宏濤 夏德萌 楊 蕊 董 昕 諶 衛 徐茂錦

(第二軍醫大學學員旅，上海 200433)

基于液相色譜串聯質譜的野生型C57BL/6衰老小鼠血清代謝物輪廓分析

郝曉偉 盧宏濤1夏德萌 楊 蕊 董 昕2諶 衛3徐茂錦3

(第二軍醫大學學員旅，上海 200433)

目的 運用代謝組學方法測定年輕小鼠與衰老小鼠血清源性物質譜的變化。方法 收集4周齡(青年組)和40周齡(衰老組)野生型雄性C57BL/6小鼠外周血清，利用超高效液相色譜串聯四級桿-飛行時間質譜(UHPLC/Q-TOF)技術對上述兩組老鼠的血清進行代謝輪廓分析，利用正交偏最小二乘法進行多變量分析，找出4周齡(青年組)與40周齡(衰老組)小鼠中含量差異顯著的內源性物質。結果 衰老組，6種不飽和脂肪酸含量低于青年組，而飽和脂肪酸，主要為硬脂酸和軟脂酸，均高于青年組；十二種溶血磷脂膽堿也明顯降低，長鏈肉堿、黃嘌呤、次黃嘌呤、視黃醛、牛磺酸和牛磺膽酸均低于青年組，而谷氨酸、色氨酸等氨基酸也出現不同幅度下降。結論 代謝組學可以找出衰老過程中的一些潛在標志物，從而推測衰老在代謝水平上的變化機制。這主要體現在脂肪酸代謝和蛋白質代謝中。

代謝組學；液質聯用；衰老；血清

年齡老化相關的疾病如肺癌、代謝綜合征、冠心病以及一些老化退行性疾病等〔1～3〕明顯增多。衰老不是簡單的年齡增長，而是身體器官和功能的衰退老化。隨著人口老齡化以及衰老低齡化的加劇，探明衰老的機制，延緩衰老進程，減少由衰老引起的疾病變得日趨重要。機體是一個有序的穩態系統，體內的物質在一定的時期內保持一個動態的相對穩定。而代謝組學是對生物體內所有內源性代謝物進行定性、定量分析，并尋找代謝物與病理生理變化的相對關系的研究方式，是系統生物學的重要組成部分〔4〕。因此運用這一新興的生物學研究手段或許有助于揭示衰老的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級野生型C57BL/6小鼠，雄性，4周齡小鼠8只，40周齡小鼠8只，從上海斯萊克實驗動物有限責任公司購置〔動物生產許可證號：SCXK(滬)2012-0002〕，飼養于第二軍醫大學SPF級生物房〔動物飼養許可證號：SYXK(滬)2012-0003〕。

1.2 實驗儀器與試劑 液相色譜系統(Agilent 1290 Infinity)；串聯四級桿-飛行時間質譜儀(Agilent6538Accurate-Mass Q-TOFMS)；高速冷凍離心機(Thermo Fisher PRESCO 17)。色譜級乙腈、色譜級甲醇，甲酸購于Fluka公司(Buchs,Switzerland)，超純水由本實驗室Milli-Q 超純水系統(Millipore,Bedford,MA,USA)制得。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣本采集 采集衰老組和青年組小鼠的血液樣本，眶靜脈取血后，先4 000 r/min離心5 min，然后分裝放置于-80℃封存。

1.3.2 代謝組輪廓分析 血液樣品前處理儀器分析前，將血清樣品常溫解凍。取100 μl血液加入300 μl甲醇，渦旋1 min，4℃靜置10 min，然后4℃ 13 000 r/min離心5 min,取上清進行液相色譜-質譜聯用(LC-MS)分析。液相色譜-質譜聯用分析將經過前處理的血樣進行UHPLC-Q/TOF MS代謝輪廓分析，采集一級質譜數據。在序列中隨機的插入質控樣品檢測系統的穩定性。數據分析將質譜數據導入Agilent Masshunter Qualitative Analysis軟件，將質譜原始數據轉換成通用的mzdata格式，并經過去同位素峰處理。在R軟件平臺下使用xcms程序對數據進行保留時間校正、峰對齊和反卷積分析。將得到的數據矩陣導入Simca-P軟件(版本11.0)分別進行主成分分析(PCA)，偏最小二乘方判別分析(PLS-DA)和正交最小二乘法分析(OPLS-DA)。并且按照PLS-DA或者OPLS的VIP值以及倍數變化系數(Fold change>2.0)挖掘差異代謝物質。依據高分辨質譜數據提供的元素匹配功能以及Metlin,HMDB,MassBank數據庫檢索對質譜峰進行初步歸屬。進一步對樣品進行高分辨MS2分析，得到差異代謝物的質譜碎片信息，通過網絡數據庫檢索和標準品比對，對差異代謝物進行結構確證。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 代謝物組學輪廓分析 青年組與衰老組的血液總離子流如圖1所示。為了篩選與衰老密切相關的生物標志物，我們采用PLS-DA的方法，正離子模式下PLS-DA的得分圖，散布圖如圖2、圖3所示，衰老組和青年組差異明顯。在散布圖中離原點越遠的點，表明對組間差異的貢獻越大。

A:正離子模式青年組;B:負離子模式衰老組;C:負離子模式青年組；D：正離子模式老年組圖1 衰老與青年組小鼠的總離子流圖

A：正離子模式；B負離子模式圖2 PLS-DA分析衰老與青年組血清代謝物輪廓分析的散布圖

A：正離子模式；B：負離子模式圖3 PLS-DA分析衰老與青年組血清代謝物輪廓分析的得分

2.2 鑒別與篩選 見表1。VIP值反映了變量在差異中的重要性，常用來篩選差異代謝物。本研究中設定差異代謝物的閾值為1。衰老組與青年組有顯著差異的變量為差異代謝物，通過對代謝物的篩選，得到了56種內源性的差異代謝物，主要包括不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸、磷脂酰膽堿、氨基酸與肉堿等。

表1 野生型C57BL/6小鼠血清差異代謝物

2.3 鑒定代謝物的響應值 衰老組6種不飽和脂肪酸含量低于青年組，而飽和脂肪酸(硬脂酸與軟脂酸)均高于青年組；衰老組與青年組相比，十二種溶血磷脂膽堿明顯降低，長鏈肉堿、黃嘌呤、次黃嘌呤、視黃醛、牛磺酸和牛磺膽酸均出現下降，而谷氨酸、色氨酸等氨基酸也有不同幅度降低。見表1。

3 討 論

衰老是多種因素共同作用的結果。在本實驗中，兩組小鼠的飼養條件完全相同，因此，我們用一定范圍的年齡增長來代表衰老的過程。在之前已有大量研究證實酯類的代謝在衰老的過程起到關鍵作用〔5,6〕，與此的一致的是，我們也發現兩組小鼠血清中多種脂肪酸有顯著變化，其中不飽和脂肪酸的含量都呈下降趨勢，共6種，油酸、亞油酸、二十碳五烯酸、2-辛烯酸、環氧-9Z-十八碳烯酸、棕櫚油酸；而兩種飽和脂肪酸均上升，分別為硬脂酸和軟脂酸〔7,8〕。不飽和脂肪酸在體內起到一個結合氧自由基、抗氧化的作用，而它們的氧化產物就是飽和脂肪酸。這與衰老的自由基學說和線粒體DNA損傷學說相契合。隨著年齡的增長，機體吸入的氧氣80%進入線粒體，隨著氧自由基不斷積累，攻擊線粒體內長脂類、DNA和蛋白質，線粒體結構與功能受損〔9〕。而線粒體的功能主要是在雙層膜上完成，生物膜主要由磷脂組成，且存在許多各種功能的蛋白質。當自由基攻擊磷脂和蛋白質時，線粒體結構被破壞，功能缺失。在實驗中，我們發現許多溶血性磷脂含量在兩組中的差異較大，而且青年組的含量明顯高于衰老組。例如，溶血磷脂酰膽堿C 20:3、C 14:0、C 18:0、sn-甘油-3-磷酸膽堿〔10〕。他們的含量隨年齡增加而減少也可能與細胞的凋亡機制有關〔11〕,或者是提示機體在能量代謝障礙和氧化損傷〔12〕

很多關于磷脂的文獻報道，中長鏈肉堿在人的肝臟的衰老中有明顯的指導意義，它在脂肪的氧化中作為載體，負責把脂肪酸轉運到線粒體中，起到關鍵的限制酶作用〔3〕。因為線粒體受到損傷，所以肉堿的含量也下降，這與我們的實驗結果一致。提示肉堿在衰老中可能是一種潛在標志物。因為線粒體損傷而受到影響的還有檸檬酸，異檸檬酸的下降，這兩個三羧酸循環的中間物質可能也說明了能量代謝伴隨衰老的減弱〔13～15〕。由于三羧酸循環在物質能量代謝中起到一個中心的作用，所以氨基酸的代謝也受到影響，L-脯氨酸、L-纈氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、精氨酸、L-色氨酸，它們的含量也隨年齡增長〔7〕。其中天冬氨酸和谷氨酸在尿素循環、葡萄糖在肌肉中的利用以及聯合脫氨中發揮重要作用〔16〕,而谷氨酸也是合成神經遞質谷氨酰胺的重要前體，這與腦疾病的發作可能有關〔17〕。而色氨酸參與絲、蘇氨酸合成，在底物磷酸化以及酶聯反應中不可缺少。鞘氨醇-1-磷酸在神經系統、心血管系統中都發揮重要功能〔18〕，我們發現它在衰老組中的含量低于青年組，這可能與許多老年神經系統和心血管疾病有關〔14〕。值得注意的是，視黃醛在兩組中的顯著差異可能揭示了老年人視力下降的原因。而牛磺酸和牛磺膽酸的減少則可能說明肝臟在衰老過程中合成膽汁的功能衰退〔13，19〕。同時黃嘌呤和次黃嘌呤是嘌呤合成中的重要物質，它們都是下降的，這可能與細胞分裂的能力減弱有關〔20〕。

本實驗采用小鼠外周血清開展了對動物衰老在代謝水平初步研究，揭示了脂類代謝和能量代謝參與了衰老過程，這其中自由基學說可能是引起衰老的主要機制，有助于進一步認識和探討衰老過程。

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〔2015-03-24修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

諶 衛(1985-)，男，主治醫師，講師，博士，主要從事腎臟病臨床與基礎研究。

郝曉偉(1993-)，男，臨床醫學專業學員，主要從事臨床醫學研究。

R4；R3

A

1005-9202(2017)06-1346-05；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.018

1 第二軍醫大學海軍醫學系 2 第二軍醫大學藥學院分析測試中心 3 第二軍醫大學長海醫院內科教研室