在實(shí)踐中重新審視真菌血清學(xué)診斷試驗(yàn)

余 進(jìn)

(北京大學(xué)第一醫(yī)院 北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心 北京市皮膚病分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100034)

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在實(shí)踐中重新審視真菌血清學(xué)診斷試驗(yàn)

余 進(jìn)

(北京大學(xué)第一醫(yī)院 北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心 北京市皮膚病分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100034)

侵襲性真菌感染血清學(xué)檢測(cè)方法應(yīng)用數(shù)年，不斷發(fā)展。鑒于實(shí)踐應(yīng)用中對(duì)其認(rèn)識(shí)日漸加深，本文對(duì)應(yīng)用價(jià)值較高的曲霉半乳甘露聚糖檢測(cè)和隱球菌莢膜多糖抗原檢測(cè)兩種方法進(jìn)行述、析、評(píng)。

真菌類;曲霉菌屬;隱球菌屬

余進(jìn)，醫(yī)學(xué)博士、主任醫(yī)師、副教授、碩士生導(dǎo)師，就職于北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科、北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心。中國(guó)微生物學(xué)會(huì)臨床微生物學(xué)委員會(huì)青年委員會(huì)副主任委員及真菌學(xué)組副組長(zhǎng)，中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)皮膚科分會(huì)性病與感染學(xué)組委員，中國(guó)微生物學(xué)會(huì)醫(yī)學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)專委會(huì)真菌學(xué)組副組長(zhǎng)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)皮膚科分會(huì)真菌學(xué)組委員。

真菌感染種類眾多，相應(yīng)的，侵襲性真菌病血清學(xué)檢查方法也比較多樣。其中針對(duì)常見(jiàn)致病真菌感染的方法應(yīng)用較為廣泛。這些方法包括針對(duì)曲霉感染的半乳甘露聚糖抗原檢測(cè)，針對(duì)隱球菌的莢膜多糖抗原檢測(cè)，針對(duì)念珠菌的甘露聚糖抗原和抗體檢測(cè)，以及相對(duì)廣譜，大部分真菌都可應(yīng)用的細(xì)胞壁β-1，3-D-葡聚糖檢測(cè)。

近10年來(lái)，國(guó)內(nèi)眾多醫(yī)院相繼開(kāi)展了血清學(xué)真菌生物標(biāo)記檢測(cè)，用于侵襲性真菌病的輔助診斷。臨床大量的實(shí)際應(yīng)用幫助我們更加深刻認(rèn)識(shí)了這些檢測(cè)方法的優(yōu)劣，豐富了各種方法的臨床解釋。我中心從2005年正式開(kāi)展真菌血清學(xué)檢測(cè)以來(lái)，迄今10年。10年間，在檢測(cè)的同時(shí)，也開(kāi)展多個(gè)病例回顧性研究。結(jié)合國(guó)內(nèi)外其他機(jī)構(gòu)進(jìn)行的研究，在此對(duì)應(yīng)用較廣的曲霉半乳甘露聚糖檢測(cè)以及隱球菌莢膜多糖抗原檢測(cè)進(jìn)行述、析、評(píng)。

1 曲霉半乳甘露聚糖檢測(cè)(GM試驗(yàn))

半乳甘露聚糖是曲霉細(xì)胞壁的組成成分，可溶于液體，在培養(yǎng)過(guò)濾液、血液、支氣管肺泡灌洗液等體液中均可檢測(cè)到。半乳甘露聚糖具有抗原性的成分是β(1-5)呋喃半乳糖殘基。目前檢測(cè)試劑盒是通過(guò)小鼠單克隆抗體與半乳甘露聚糖抗原結(jié)合，采用酶連免疫吸附試驗(yàn)方法。

半乳甘露聚糖抗原檢測(cè)具有一定的種屬特異性，一般認(rèn)為對(duì)曲霉特異。如果出現(xiàn)陽(yáng)性，提示曲霉感染的可能。但是，隨著研究涉及真菌感染種類的增加，也發(fā)現(xiàn)半乳甘露聚糖抗原在某些非曲霉的真菌感染中存在一定的交叉陽(yáng)性反應(yīng)，例如，馬爾尼菲青霉、鐮刀菌感染；某些隱球菌患者也可能出現(xiàn)較低滴度的陽(yáng)性。由于曲霉感染相對(duì)更為多見(jiàn)，所以目前仍將其作為侵襲性肺曲霉病(IPA)的診斷標(biāo)準(zhǔn)。在2008年歐洲癌癥研究治療組織真菌病研究組和過(guò)敏性和感染性疾病學(xué)會(huì)真菌病研究組(EROCT/MSG)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)中，GM試驗(yàn)作為間接證據(jù)支持IPA的臨床診斷[1]。2016年美國(guó)感染病學(xué)會(huì)(IDSA)推出的新版曲霉診斷治療指南中，推薦對(duì)懷疑IPA的患者進(jìn)行GM檢查[2]。

IPA多見(jiàn)于血液病患者，尤其是骨髓或干細(xì)胞移植的患者。GM試驗(yàn)的開(kāi)展能夠幫助血液科醫(yī)生更加早期準(zhǔn)確地診斷或排除曲霉感染。血液科醫(yī)生在應(yīng)用中提出IPA的診斷思路[3]：借助肺部CT和血清GM試驗(yàn)兩項(xiàng)檢查，如果CT陽(yáng)性，GM陰性可以開(kāi)始經(jīng)驗(yàn)性治療，需要監(jiān)測(cè)CT1～2 周，如果CT顯示病情好轉(zhuǎn)，繼續(xù)治療；如果CT陽(yáng)性，GM也陽(yáng)性，可以開(kāi)始抗真菌治療，同時(shí)監(jiān)測(cè)GM值，若出現(xiàn)下降提示預(yù)后好，若GM持續(xù)陽(yáng)性則需要考慮菌株耐藥、假陽(yáng)性、合并其他感染等問(wèn)題；如果CT陰性，GM陰性，可以排除IPA。初次檢測(cè)GM數(shù)值的高低以及治療后下降轉(zhuǎn)陰的情況會(huì)影響患者預(yù)后，一般基線時(shí)GM數(shù)值高，下降慢提示預(yù)后不佳[4]。

GM試驗(yàn)在不同人群中應(yīng)用價(jià)值也存在差異。在骨髓移植患者中，其敏感度和特異度分別為82%和86%，最為適用；在血液系統(tǒng)惡性病中，其敏感度和特異度分別為70%和92%，也可以應(yīng)用；而在實(shí)體器官移植患者中，敏感度下降到22%，特異度為84%。其中肝移植患者中敏感度55.6%，肺移植患者敏感度30%，重癥監(jiān)護(hù)科(ICU)患者敏感度25%。另外，成年人和兒童也有差異，兒童假陽(yáng)性率高于成年人[5]。我國(guó)學(xué)者在應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)同為ICU患者，伴隨粒細(xì)胞缺乏者與非粒細(xì)胞缺乏接受影響免疫功能治療者，以及非粒細(xì)胞缺乏未接受影響免疫功能治療者，GM試驗(yàn)在這3組人群中的敏感度有較大差異，分別為80%，70%和53.8%；特異度均為92.6%[6]。

血清GM檢測(cè)已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可，但其結(jié)果并不令人完全滿意，各種研究均顯示出其特異度較好，敏感度略為遜色，盡管采用降低診斷界值的手段一定程度上提高了敏感度，但其仍徘徊于70%。血清GM升高與肺內(nèi)真菌載量，血管侵犯程度和患者免疫狀態(tài)均有關(guān)。肺內(nèi)真菌載量低，血管侵犯輕，釋放入血液中的GM抗原會(huì)減少，患者免疫狀態(tài)好，血液中的GM抗原清除會(huì)加快。這些不足導(dǎo)致僅僅通過(guò)血清GM抗原檢測(cè)難于更早，更靈敏的作出診斷。為了進(jìn)一步提高診斷的敏感度，支氣管肺泡灌洗液(BALF)作為一種新的檢測(cè)樣本進(jìn)入了人們的視線。在血液系統(tǒng)惡性病、造血干細(xì)胞移植患者中，BALF中GM值的升高能夠提高IPA診斷的敏感度。不僅如此，對(duì)于非血液病患者，BALF也能顯著提高診斷的效率。我中心曾比較BALF和血清GM試驗(yàn)在非血液病人群的診斷價(jià)值，研究顯示BALF更為敏感，達(dá)到85.4%，同時(shí)取血清GM試驗(yàn)的敏感度為67.9%[7]。盡管提高了敏感度，BALF更容易出現(xiàn)假陽(yáng)性情況，可能與曲霉氣道定植有關(guān)。在肺移植患者中，呼吸道曲霉定植者，其BALF的GM結(jié)果在0.5～1.0之間，出現(xiàn)IPA時(shí)，BALF值多大于1.0[5]。目前認(rèn)為可以通過(guò)提高對(duì)BALF的診斷界值來(lái)降低假陽(yáng)性率。我們的研究也顯示BALF界值在1.19時(shí)，敏感度和特異度都較好[7]。但是，BALFGM的診斷界值至今沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，這是因?yàn)锽ALF灌洗尚未標(biāo)準(zhǔn)化，不同的研究灌洗量差異較大。此外，BALFGM與灌洗部位相關(guān)，臨床上應(yīng)結(jié)合CT表現(xiàn)，在病變部位灌洗。盡管BALFGM檢測(cè)存在標(biāo)準(zhǔn)化的問(wèn)題，目前認(rèn)為其具有重要價(jià)值，尤其是針對(duì)非血液病患者，例如慢性阻塞性肺疾病和應(yīng)用免疫抑制劑人群[8]。2016版IDSA曲霉病診斷治療指南中也著重推薦對(duì)懷疑IPA的患者進(jìn)行BALFGM，同時(shí)還可以作為治療監(jiān)測(cè)指標(biāo)[2]。

IPA診斷中，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)診斷是重要的一部分。很多研究比較了GM試驗(yàn)和PCR方法在IPA診斷中的價(jià)值。多數(shù)研究顯示二者互補(bǔ)，如果能同時(shí)進(jìn)行GM和PCR檢查，診斷的效率更高[9-10]。我們?cè)鴮?duì)一組同時(shí)對(duì)血清和BALF進(jìn)行GM和PCR檢測(cè)的患者進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)血清檢測(cè)中，GM和PCR二者敏感度和特異度相當(dāng)；BALF檢測(cè)中，GM試驗(yàn)和PCR檢測(cè)敏感度相同，特異度方面，PCR優(yōu)于GM；二者聯(lián)合，效果更佳[11]。

對(duì)于IPA的診斷，除了GM試驗(yàn)和PCR檢測(cè)外，β-1，3-D-葡聚糖檢測(cè)(G試驗(yàn))也可覆蓋曲霉。比較二者對(duì)IPA診斷價(jià)值的研究結(jié)果變異較大，綜合來(lái)看，GM試驗(yàn)特異度好；G試驗(yàn)敏感度高，但容易出現(xiàn)假陽(yáng)性[12]。國(guó)產(chǎn)G試驗(yàn)檢測(cè)試劑尤其要注意假陽(yáng)性問(wèn)題。

2 隱球菌莢膜多糖抗原檢測(cè)

隱球菌莢膜多糖抗原檢測(cè)主要有3種方法，乳膠凝集法(LA)、酶聯(lián)免疫分析法(EIA)和膠體金免疫沉淀法(LFA)。三者對(duì)隱球菌病診斷價(jià)值均較高。其中LFA是2009年Immuno-Mycologics(IMMY)公司推出的診斷試劑，操作更為簡(jiǎn)便，反應(yīng)時(shí)間縮短到10分鐘，結(jié)果更客觀，可進(jìn)行定性和半定量檢測(cè)。將EIA和LFA進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)[13]，二者一致性為97%，LFA更敏感，對(duì)于隱球菌病診斷的敏感度和特異度分別為100%和99.6%。

隱球菌病最常見(jiàn)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，即隱球菌性腦膜炎。在2008年EROCT/MSG診斷標(biāo)準(zhǔn)中，腦脊液莢膜多糖抗原陽(yáng)性可以作為隱球菌性腦膜炎確診證據(jù)。在肺隱球菌病中，血清莢膜多糖抗原陽(yáng)性同樣具備很高的敏感度和特異度。我院呼吸科曾對(duì)疑診肺部隱球菌感染的患者27例同時(shí)進(jìn)行血清莢膜多糖抗原乳膠凝集檢測(cè)和肺活檢組織病理檢查，經(jīng)組織病理證實(shí)肺隱球菌病9例，這9例患者乳膠凝集試驗(yàn)全部陽(yáng)性；病理證實(shí)18例非隱球菌感染患者，乳膠凝集試驗(yàn)全部陰性[14]。近期一項(xiàng)針對(duì)晚期AIDS并且開(kāi)始抗病毒治療的患者篩查隱球菌抗原的前瞻性研究顯示，抗原陽(yáng)性即開(kāi)始氟康唑治療可以顯著降低隱球菌性腦膜炎的發(fā)生率[15]。

莢膜多糖抗原檢測(cè)除了可以用于腦脊液和血清的檢測(cè)外，也可以用于尿標(biāo)本。在一篇評(píng)價(jià)LFA診斷價(jià)值的系統(tǒng)綜述中，作者認(rèn)為盡管尿標(biāo)本應(yīng)用還需要更進(jìn)一步的研究，就現(xiàn)有數(shù)據(jù)來(lái)看，尿中莢膜多糖抗原檢測(cè)在隱球菌病診斷中顯示了良好的應(yīng)用前景[16]。

GM試驗(yàn)和莢膜多糖抗原檢測(cè)在應(yīng)用中獲得廣泛認(rèn)可，除此之外，其他真菌血清生物標(biāo)記檢測(cè)，例如G試驗(yàn)，甘露聚糖抗原和抗體檢測(cè)也受到重視。就目前來(lái)看，侵襲性真菌病病例相對(duì)少見(jiàn)，確診困難，現(xiàn)有診斷標(biāo)準(zhǔn)存在缺陷，這些都對(duì)早期血清學(xué)標(biāo)記的客觀評(píng)價(jià)造成干擾。在選擇檢測(cè)方法時(shí)，我們尤其要關(guān)注其大樣本臨床應(yīng)用的結(jié)果，關(guān)注其長(zhǎng)期應(yīng)用后的臨床評(píng)價(jià)。只有在實(shí)踐應(yīng)用中不斷重新審視真菌血清學(xué)診斷方法，才能加深認(rèn)識(shí)，客觀、理性評(píng)價(jià)各種方法。

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Re-inspectiononfungalserumdiagnosisinpractice

YuJin

ResearchCenterforMedicalMycology，DepartmentofDermatologyandVenereology，PekingUniversityFirstHospital，BeijingKeyLaboratoryofMolecularDiagnosisofDermatoses，PekingUniversity，Beijing100034，China

Correspondingauthor:YuJin，Email:yujin676@126.com

Fungalserumdiagnosticexaminationsforinvasivefungalinfectionshavebeenusedforyearsandarecontinuouslyimproving.Inviewoftheknowledgeincreasing，hereintoreview，analyzeandevaluatethemosttwovaluabletestsofgalactomannanforaspergillosisandcapsularpolysaccharidesantigenforcryptococcosis.

eumycophyta;aspergillus;cryptococcus

，余進(jìn)，Email:yujin676@126.com

R

A

1004-583X(2017)04-0281-03

10.3969/j.issn.1004-583X.2017.04.002

2017-02-07 編輯:武峪峰