免疫球蛋白輕鏈在糖尿病腎病中的變化及意義

崔 雪，楊 林，李 娟，馬利霞

(河北醫科大學第二醫院 腎內科，河北 石家莊 050000)

·論著·

免疫球蛋白輕鏈在糖尿病腎病中的變化及意義

崔 雪，楊 林，李 娟，馬利霞

(河北醫科大學第二醫院 腎內科，河北 石家莊 050000)

目的 探討血清游離輕鏈 (freelightchains，FLCs)與糖尿病腎病(DN)患者的臨床指標及腎病理病變的關系。方法 選取腎內科住院，并經腎活檢診斷的DN患者40例為試驗組，非DN患者40例為對照組，兩組患者均除外慢性炎癥性疾病。記錄患者血肌酐、尿蛋白、超敏C反應蛋白(hs-CRP)、同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)等臨床指標。應用間接免疫熒光法檢測各腎標本中λFLC及κFLC的表達情況，并記錄其光鏡下腎臟病變情況。測定各患者λFLC及κFLC濃度。探討FLCs與DN患者臨床指標及腎病理病變的關系。 結果 試驗組入院時hs-CRP及Hcy均高于對照組(P<0.05)。與對照組相比，試驗組血清cFLC(combinedfreelightchain，cFLC)(κFLC與λFLC之和)水平明顯升高(P<0.05)。臨床指標與cFLC進行相關性分析，結果顯示Hcy、hs-CRP與cFLC呈正相關(P<0.05)，病理學指標與cFLC進行相關性分析，DN腎間質小管病變評分與cFLC水平呈正相關(P<0.05)，與eGFR呈負相關(P<0.05)。結論FLCs可能可以作為預測DN患者死亡風險，尤其是預測心血管疾病風險的指標，并可以作為DN患者疾病進展的評估指標。

糖尿病腎病；免疫球蛋白輕鏈；心血管疾病；死亡；危險因素

糖尿病腎病(diabeticnephropathy，DN)已逐漸成為發達國家及發展中國家慢性腎衰竭的最常見病因之一，且發生率呈逐年上升趨勢[1-2]。患者的死亡(尤其是心血管病變引起)及進展至終末期腎病(end-stagerenaldisease，ESRD)的風險比非慢性腎臟病(chronickidneydisease，CKD)患者明顯增大，并且DN的嚴重程度與其心血管事件概率是呈正相關[3]。血清游離輕鏈(freelightchains，FLCs)是由B細胞產生的免疫球蛋白的組成部分，最近幾年越來越多的研究發現其在炎癥反應中的作用，并推測其可能成為免疫性疾病中炎癥反應的預測性指標[4]。cFLC(combinedfreelightchain，cFLC)水平在慢性炎癥及腎功能不全狀態下會升高[5]，而這兩種狀態正是2型糖尿病所具有的重要病生理狀態及其可能造成的主要靶器官損害之一。有研究發現cFLC水平也許可以預測糖尿病患者心血管疾病(CVD)風險，本研究旨在觀察cFLC與DN患者的臨床指標及腎病理病變的關系及其意義。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 選取2014年2月至2015年7月在河北醫科大學第二醫院腎內科住院，并經腎活檢診斷的DN患者40例為試驗組，非DN患者40例為對照組，留取腎組織冰凍切片備用。入選標準：①年齡>18周歲；②腎病理診斷為DN。排除標準：系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、過敏性皮膚炎、哮喘、鼻炎、食物過敏、特發性肺間質纖維化、過敏性肺炎、慢性阻塞性肺疾病、炎癥性腸病、多發性硬化、結核、骨髓炎。

1.2 方法

1.2.1 光鏡觀察 根據DN的病理診斷標準[6]對經過碘酸-銀-烏洛托品(periodicacid-silver-meth-enamine，PASM) +Masson染色的標本進行光鏡病理學診斷。

1.2.2 間接免疫熒光法觀察λFLC、κFLC的表達及分布 4μm厚的腎組織冰凍切片，經10%正常牛血清白蛋白室溫封閉20分鐘，λFLC抗體、κFLC抗體(1:200，北京中杉金橋生物制劑公司)恒溫水浴箱(37 ℃)孵育60分鐘。異硫氰酸熒光素(FITC) 標記山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物制劑公司) 37 ℃孵育60分鐘。熒光顯微鏡下觀察并記錄結果，用數碼相機拍照。

1.2.3 腎組織病理學檢查 腎活檢組織用福爾馬林-醋酸-酒精固定液(FAA)固定過夜，常規脫水、浸蠟、包埋、切片(2μm)，作PASM+Masson染色。顯微鏡下觀察并記錄病變情況。

1.2.4 患者血清標本收集 獲得所有受試者知情同意，囑其采血前日19:00以后禁食水，并于次日清晨7:00用促凝管采取肘靜脈血8ml，在離心機中以4 000r/min速度離心15分鐘后，分離血清，置于-70 ℃冰箱內保存備用。待所有受試對象血清收集完全，應用酶聯免疫試劑盒(ELISA)試劑盒測定其λFLC及κFLC濃度。

1.2.5 臨床指標檢測 記錄患者年齡、性別、吸煙史及血壓最高值，采用患者入院后首次檢測結果，記錄血紅蛋白、糖化血紅蛋白、血電解質、血肌酐、血脂、血白蛋白、尿蛋白、超敏C反應蛋白(hs-CRP)、同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)等臨床指標，并根據患者血肌酐值應用CKD-EPI公式計算患者腎小球濾過率估計值(eGFR)。

2 結 果

2.1 臨床資料結果 試驗組收縮壓顯著高于對照組，兩組舒張壓比較差異無統計學意義。試驗組腎功能平水平較對照組差，eGFR明顯低于對照組。兩組血脂、電解質指標比較差異無統計學意義。兩組近期均無感染情況，入院時測hs-CRP均在我院標準正常范圍內(0～8mg/L)，試驗組顯著高于對照組。試驗組Hcy高于對照組。試驗組糖尿病病史平均7.5年，入院后查糖化血紅蛋白>7%的比例為53%，眼底情況檢查率為70%，其中存在糖尿病視網膜病變的比例為59%。見表1。

2.2ELISA檢測結果 血清游離輕鏈的正常值[7]：血清κFLC3.3～19.4mg/L；λFLC5.7～26.3mg/L；κ/λ比值0.26～1.65，cFLC水平為κFLC與λFLC之和，試驗組水平與對照組相比明顯升高。見表1。

2.3 腎組織病理情況

2.3.1 冰凍切片免疫熒光結果DN標本中，表達位置主要位于腎小球系膜區(圖1、2)；膜性腎病標本中，表達位置主要位于腎小球血管壁；IgA腎病標本中，表達位置主要位于腎小球系膜區，兩種輕鏈的表達位置無差異。

2.3.2 石蠟切片光鏡結果 試驗組按DN病理診斷分型標準，Ⅰ級DN4例，Ⅱ級DN16例，Ⅲ級DN16例，Ⅳ級DN4例，對照組膜性腎病10例，IgA腎病10例，腎小球微小病變及局灶節段性腎小球硬化各10例。試驗組腎小球硬化率比例明顯高于對照組。在試驗組中，不同DN級別間的腎小球硬化率相互比較，Ⅳ級與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級DN之間的差別有統計學意義，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級這3組之間差異無統計學意義。試驗組腎小管萎縮程度及動脈硬化比例較對照組嚴重，根據DN腎間質小管病變評分標準，Ⅰ級DN評分2～4分，Ⅱ級DN評分2～5分，Ⅲ級DN評分4～6分，Ⅳ級DN評分5～7分，DN4個分級間間質小管病變評分、cFLC差異無統計學意義。

圖1 DN患者κFLC熒光圖像 (免疫熒光×400)

圖2 DN患者λFLC熒光圖像 (免疫熒光×400)

組別例數年齡(歲)男性比例(%)吸煙(%)收縮壓(mmHg)舒張壓(mmHg)血肌酐(μmol/L)eGFR[ml/(min·1．73m2)]糖化血紅蛋白(%)試驗組4052±94728173±3493±9124．8±24．672±347．7±1．8對照組4045±125921129±2482±1273．8±14．0105±316．2±1．0統計值t=2．341χ2=1．800χ2=22．500t=2．774t=0．807t=3．180t=4．130t=3．491P值0．0540．8330．3100．0070．4230．0020．0000．005組別例數血紅蛋白(g/L)血白蛋白(g/L)尿蛋白(g/24h)甘油三酯(mmol/L)總膽固醇(mmol/L)血鉀(mmol/L)血鈉(mmol/L)血鈣(mmol/L)血磷(mmol/L)試驗組40113±1929±56．7±4．21．91±0．757．4±2．33．9±0．7139．6±5．72．16±0．151．26±0．22對照組40135±1735±83．2±2．71．97±0．876．0±2．24．2±0．4140．1±4．22．18±0．091．25±0．16統計值t=6．928t=0．759t=2．258t=0．335t=0．843t=1．796t=0．674t=1．689t=1．908P值0．0000．4560．0270．7210．4020．0770．5030．0960．061組別例數Hcy(μmol/L)hs?CRP(mmol/L)λFLC(mg/L)κFLC(mg/L)κ/λcFLC(mg/L)腎小球硬化率(%)腎小管萎縮度(%)腎小動脈病變率(%)試驗組4015．06±6．353．88±1．1422．83±3．3032．41±8．931．45±0．4755．24±9．2427±1842±1478對照組406．89±2．471．58±0．679．67±4．8012．16±4．591．56±0．9221．83±7．6210±815±841統計值t=4．900t=10．087t=13．362t=12．897t=0．342t=17．246t=4．992t=9．908t=13．700P值0．0000．0000．0000．0000．5480．0010．0020．0050．003

2.4 各組指標間相關性分析 臨床指標與cFLC進行相關性分析，收縮壓、血肌酐、糖化血紅蛋白、Hcy、hs-CRP與cFLC呈正相關，eGFR、血紅蛋白與cFLC呈負相關(表2)。病理學指標與cFLC進行相關性分析，隨著腎小球硬化比例及腎小管萎縮程度的加重，cFLC水平逐漸升高。DN腎間質小管病變評分與cFLC水平呈正相關，腎間質小管病變較重時，cFLC水平相對較高，見表3。

表2 臨床指標與cFLC的相關性分析

表3 試驗組腎臟病理數據與其eGFR及cFLC的相關性分析

3 討 論

CKD是人類死亡的重要危險因素之一，人們一直在研究是否存在一些生物標志物可以預測普通人群及CKD人群心血管事件的發生風險[8]。人們一直致力于找到一種能在疾病早期即可預測CVD風險的指標，從而采取更積極的措施來降低事件的發生率，從而降低人群病死率。C反應蛋白(CRP)是在檢測中較為常用的指標，作為機體急性反應時相的標志物，是評價普通人群及CKD患者炎癥反應的一個可靠指標[9-11]。現有的超敏檢測技術可以檢測人體內低濃度的CRP，即hs-CRP，它可以作為冠脈事件的預測指標[12]，當血濃度hs-CRP>3mg/L時，其可以作為其冠脈事件風險的標志[13]。一項研究2型糖尿病患者FLC與其CVD風險的相關研究指出[14]，FLC在預測CVD風險方面比CPR更可靠，且在經胰島素應用史、他汀類及血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)類藥物應用史矯正后，cFLC仍有統計學意義。其他涉及CRP及FLC的研究顯示，FLC比CRP的關聯性更強。研究發現可以將FLC作為一系列死亡危險因素的生物標志物[15]。本研究證實DN患者比其他類型CKD患者的cFLC和收縮壓水平高，cFLC與hs-CRP、收縮壓之間存在線性相關，FLC可能可以作為DN患者CVD風險的預測指標。

Hcy是甲硫氨酸代謝過程中產生的一種含硫氨基酸，目前被認為是動脈粥樣硬化及血栓性疾病等心腦血管疾病的獨立危險因素[16]。作為心血管病變的獨立危險因素，Hcy可能也參與了CKD患者的心血管病變[17-18]。腎臟是Hcy合成及代謝的一個主要場所。腎小球濾過率減少或者腎小管上皮細胞代謝障礙會對血液中的Hcy的濃度會產生一定影響。研究表明，Hcy水平的升高和eGFR下降密切相關， 因此Hcy被認為是CKD患者病情進展的獨立危險因素[19]。過高的hs-CRP及Hcy均與CKD的高風險相關，有可能成為成年CKD患者風險的有效評估指標[20]。本研究結果顯示，隨著Hcy水平的升高，cFLC水平升高，eGFR水平下降。

CKD患者腎功能損傷的程度與腎小球病變程度有關，但是與間質小管損傷程度相關性更好[21]。這是因為間質小管損傷的程度與蛋白尿的水平是相關的。在超負荷蛋白的腎病綜合征狀態下，間質小管病變是標志性損傷[22]。Zoja等[23]研究發現，蛋白尿對近端腎小管上皮細胞(proximaltubularepithelialcell，PTEC)有促炎及促纖維化的作用。當FLC不能完全被腎小管重吸收時，長時間則會造成小管間質的損傷。FLCs在PTEC內吞后，經一系列作用，再次進入血液循環，誘導白細胞介素(IL)6、IL-8及單核細胞趨化因子1(MCP-1)等炎癥因子的釋放，促進間質纖維化。FLCs還可促進上皮細胞表型轉換為肌成纖維細胞。FLCs進入上皮細胞的同時，會促進細胞內過氧化氫(hydrogenperoxide，H2O2)的生成及靶向攻擊，進一步誘導核因子(NF)κB成為激活狀態，促進炎癥因子的表達，進而釋放入血。炎癥細胞的聚集，促進了間質纖維化的進展。同時當小管上皮細胞暴露于一定濃度的輕鏈環境中時，某些炎癥因子，如MCP、IL、α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、轉化生長因子(TGF)等會促進上皮細胞間充質轉化，促進間質纖維化的發生[24]。這些反應是蛋白尿(包括DN)患者間質小管損傷及腎臟功能衰竭的關鍵因素。

腎小球病變一直被認為是DN最主要的特征，但腎小管萎縮與間質纖維化也參與了疾病的進展， 且與腎功能下降密切相關[25]。多項研究結果表明，間質纖維化的程度與腎小球球性廢棄比例一樣， 均與高血壓、蛋白尿相關，并與GFR呈負相關。本研究的結果也支持上述觀點。小管間質損傷主要是通過其炎癥因子的分泌及細胞骨架蛋白的改變造成腎臟損傷[26]。DN的腎間質組織中主要是單核細胞、巨噬細胞、肥大細胞及T細胞浸潤。這些細胞與作用于血管的肽類物質及生長因子緊密結合，造成局部組織損傷。腎小管間質的病變可能在腎功能不全患者進展至ESRD中占據更主要的決定作用。本研究結果提示cFLC與間質小管病變及小球硬化比例之間存在相關性，故推測其可以用于評價DN腎臟病情，對于DN預后的評估提供更可靠地依據。

綜上所述，DN血清游離輕鏈與hs-CRP、Hcy呈正相關，與eGFR呈負相關，可能可以作為預測DN患者死亡風險，尤其是預測CVD風險的指標。血清游離輕鏈與其腎間質小管病變程度呈正相關，可以作為DN患者疾病進展的評估指標。本試驗為橫斷面研究且樣本量較小，需要進一步隨訪，前瞻觀察患者病情進展及并發癥情況來支持實驗結論。

[1]VasavadaN，AgarwalR.Roleofoxidativestressindiabeticnephropathy[J].AdvChronicKidneyDis， 2005， 12(2):146-154.

[2]deBoerIH，RueTC，HallYN，etal.TemporaltrendsintheprevalenceofdiabetickidneydiseaseintheUnitedStates[J].JAMA， 2011， 305 (24):2532-2539．

[3]DineenSF，GersteinHC.Theassociationofmicroalbuminuriaandmortalityinnon-insulin-dependentdiabetesmellitus.Asystematicoverviewoftheliterature[J].ArchInternMed， 1997，157(13):1413-1418.

[4]RitchieJ，AssiLK，BurmeisterA，etal.AssociationofserumIgfreelightchainswithmortalityandESRDamongpatientswithnondialysis-dependentCKD[J].ClinJAmSocNephrol， 2015，10(5): 740-749.

[5]HutchisonCA，HardingS，HewinsP，etal.Quantitativeassessmentofserumandurinarypolyclonalfreelightchainsinpatientswithchronickidneydisease[J].ClinJAmSocNephrol， 2008，3(6):1684-1690.

[6]TervaertTW，MooyaartAL，AmannK，etal.Pathologicclassificationofdiabeticnephropathy[J].AmSocNephrol，2010，21(4):556-563.

[7]KatzmannJA，ClarkRJ，AbrahamRS，etal.Serumreferenceintervalsanddiagnosticrangesforfreekappaandfreelambdaimmunoglobulinlightchains:relativesensitivityfordetectionofmonoclonallightchains[J].ClinChem，2002，48(9): 1437-1444.

[8]VickeryS，WebbMC，PriceCP，etal.Prognosticvalueofcardiacbiomarkersfordeathinanon-dialysischronickidneydiseasepopulation[J].NephrolDialTransplant， 2008，23(11): 3546-3553.

[9]GargAX，BlakePG，ClarkWF，etal.Associationbetweenrenalinsufficiencyandmalnutritioninolderadults:resultsfromtheNHANESIII[J].KidneyInt，2001，60(5):1867-1874.

[10]ShlipakMG，FriedLF，CrumpC，etal.Elevationsofinflammatoryandprocoagulantbiomarkersinelderlypersonswithrenalinsufficiency[J].Circulation，2003，107(1):87-92.

[11]HsuHJ，YenCH，HsuKH，etal.Chronickidneydiseasestageisamodulatorontheassociationbetweenhigh-sensitivityC-reactiveproteinandcoronaryvasospasticangina[J].ScientificWorldJournal， 2014，2014:852507.

[12]RidkerPM.ClinicalapplicationofC-reactiveproteinforcardiovasculardiseasedetectionandprevention[J].Circulation， 2003，107(3):363-369.

[13]PearsonTA，MensahGA，AlexanderRW，etal.Markersofinflammationandcardiovasculardisease:applicationtoclinicalandpublichealthpractice:astatementforhealthcareprofessionalsfromthecentersfordiseasecontrolandpreventionandtheAmericanHeartAssociation[J].Circulation， 2003，107(3):499-511.

[14]AnandramS，AssiLK，LovattT，etal.Elevated，combinedserumfreelightchainlevelsandincreasedmortality:A5-yearfollow-up，UKstudy[J].JClinPathol， 2012，65(11): 1036-1042.

[15]BellaryS，FaintJM，AssiLK，etal.Elevatedserumfreelightchainspredictcardio-vasculareventsintype2diabetes[J].DiabetesCare，2014，37(7): 2028-2030.

[16]ClarkeR，DalyL，RobinsonK，etal.Hyperhomocysteinemia:anindependentriskfactorforvasculardisease[J].NEnglJMed，1991， 324(17): 1149-1155．

[17]LeviA，CohenE，LeviM，etal.Elevatedserumhomocysteineisapredictorofaccelerateddeclineinrenalfunctionandchronickidneydisease:ahistoricalprospectivestudy[J].EurJInternMed，2014，25(10):951-955．

[18]PotterK，HankeynGJ，GreenDJ，etal.Homocysteineorrenalimpairment:whichistherealcardiovascularriskfactor[J].ArteriosclerThrombVascBiol，2008，28(6):1158-1164．

[19]ChuangCH，LeeYY，SheuBF，etal.HomocysteineandC-reactiveproteinasusefulsurrogatemarkersforevaluatingCKDriskinadults[J].KidneyBloodPressRes，2013，37(4-5):402-413．

[20] 程清.脂蛋白相關磷脂酶A2和同型半胱氨酸水平與動脈粥樣硬化性心腦血管疾病關系的研究[J].檢驗醫學，2015，30(1): 40-43．

[21]NathKA.Tubulointerstitialchangesasamajordeterminantintheprogressionofrenaldamage[J].AmJKidneyDis， 1992，20(1):1-17.

[22]EddyAA，McCullochL，LiuE，etal.Arelationshipbetweenproteinuriaandacutetubulointerstitialdiseaseinratswithexperimentalnephroticsyndrome[J].AmJPathol， 1991，138(5):1111-1123.

[23]ZojaC，MorigiM，FigliuzziM，etal.Proximaltubularcellsynthesisandsecretionofendothelin-1onchallengewithalbuminandotherproteins[J].AmJKidneyDis， 1995，26(6):934-941.

[24]BasnayakeK，StringerSJS，HutchisonCAC，etal.Thebiologyofimmunoglobulinfreelightchainsandkidneyinjury[J].KidneyInt， 2011，79(12): 1289-1301.

[25]TangSC，LeungJC，LaiKN.Diabetictubulopathy:anemergingentity[J].ContribNephrol，2011，170:124-134．

[26]SanaiT，SobkaT，JohnsonT，etal.Expressionofcytoskeletalproteinsduringthecourseofexperimentaldiabeticnephropathy[J].Diabetologia， 2000，43(1)：91-100.

Changesandsignificanceofimmunoglobulinlightchainindiabeticnephropathy

CuiXue，YangLin，LiJuan，MaLixia

DepartmentofNephrology，theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050000，China

Correspondingauthor:YangLin，Email:yanglin2943@163.com

ObjectiveToinvestigatetherelationshipsamongserumfreelightchains(FLCs)andclinicalindicatorsandrenalpathologicalchangesofdiabeticnephropathy(DN).MethodsFortyDNpatientsand40non-DNpatientswereenrolled.Theparticipantsweredividedintoexperimentandcontrolgroup，butchronicinflammatorydiseasewasexclued.Serumcreatinine，urinaryprotein，hs-CRPandHcywereobserved.TheλFLCandκFLCweredetectedbyindirectimmunofluorescence.Furthermore，weobservedtherenalpathologicalchangesbylightmicroscope.TheλFLCandκFLCweredeterminedthroughELISA.UnivariateanalysiswasusedtoexaminetherelationshipsbetweenFLCsandclinicalindicatorsandrenalpathologicalchangesofDN.ResultsTheexperimentgrouphadhigherhsCPRandHcylevelthanthecontrolgroup(P<0.05).ThelevelsofcFLC(ThesumofλFLCandκFLC)intheexperimentgroupwerehighercomparedwiththecontrolgroup(P<0.05).TheHcyandhs-CRPwerepositivelycorrelatedwithcombinedfreelightchain(cFLC) (P<0.05).Thescoresoftubulointerstitiallesionsshowedpositivecorrelations(P<0.05)withcFLC，butnegativelycorrelatedwitheGFR(P<0.05).ConclusionThelevelofcFLCcouldbeapredictoroftheriskofmortality(especiallycardiovasculardiseasecaused)ofDNpatientsandtheprogressionofDN.

diabeticnephropathies；immunoglobulinlightchains；cardiovasculardiseases；death；riskfactors

楊林，Email:yanglin2943@163.com

R

A

1004-583X(2017)04-0305-05

10.3969/j.issn.1004-583X.2017.04.008

2016-10-26 編輯:張衛國