嵌合抗原受體T細胞在白血病中的研究及應用

王文媛，李莉娟，許麗麗，周 文，張連生

(蘭州大學第二臨床醫學院 蘭州大學第二醫院 血液科，甘肅 蘭州 730030)

·綜述·

嵌合抗原受體T細胞在白血病中的研究及應用

王文媛，李莉娟，許麗麗，周 文，張連生

(蘭州大學第二臨床醫學院 蘭州大學第二醫院 血液科，甘肅 蘭州 730030)

嵌合抗原受體T細胞是通過單抗識別腫瘤抗原，將抗原抗體的高親和性與T細胞的殺傷作用相結合，通過非MHC限制性的方法特異性殺傷腫瘤細胞。目前嵌合抗原受體T細胞CD19在治療急性淋巴細胞白血病(ALL)及慢性淋巴細胞白血病(CLL)中均取得了良好的療效。本文將嵌合抗原受體T細胞在ALL及CLL中治療進展做一綜述。

白血病，T細胞;T淋巴細胞；嵌合素蛋白質類

嵌合抗原受體(chimericantigenreceptor，CAR)T細胞療法是近年來發展非常迅速的一種新的細胞免疫治療技術。目前，CAR技術已從基本理論研究過渡到臨床應用，在血液系統腫瘤和實體瘤的治療上取得了顯著成績。本文將CAR-T技術在急性淋巴細胞白血病(ALL)及慢性淋巴細胞白血病(CLL)的治療進展做一介紹。

1 CAR-T作用機制

CAR-T療法是通過單抗識別腫瘤抗原，將抗原抗體的高親和性和T淋巴細胞的殺傷作用相結合，構建特異性CAR[1]。通過病毒載體、轉位子融合、電穿孔等方式[2]將編碼CAR的基因插入到T淋巴細胞使T淋巴細胞表達這種CAR，然后經體外擴增純化這種基因修飾過的T細胞，輸入到體內。CAR-T在體內特異性識別靶抗原，通過活化擴增及分泌細胞因子，以非主要組織相容性抗原(MHC)限制性的方式特異性殺傷靶細胞[3]。同時CAR-T細胞不僅可識別蛋白質抗原，也可識別糖類抗原[4]、蛋白多糖[5]、糖化蛋白[6]、神經節苷脂[7]，擴大了靶向抗原的范圍。理想的腫瘤靶抗原是僅表達在腫瘤細胞上，而不表達在正常細胞上，也不進入循環系統，且為腫瘤細胞生長存活所必須，這樣就大大減小了CAR治療的選擇壓力[8]。

2 CAR的基本結構及發展

目前，大多數CAR由胞外抗原結合區[由來源于單克隆抗體的輕鏈(VL)和重鏈(VH)組成， 中間由帶韌性的鉸鏈區連接形成單鏈抗體(singlechainfragmentvariable，scFv)]、跨膜區域和胞內信號轉導區組成[9-10]。第一代CAR-T將免疫球蛋白樣scFv和FcεRI受體(γ鏈)或CD3復合物(ζ鏈)胞內結構域融合形成嵌合受體[11]。第二代CAR-T細胞加入了共刺激分子，如CD28，CD27，CD134(OX40)[12-13]，CD137(4-1BB)[14]，DAP10[15]。這些共刺激分子能提供不同的效應功能，相比于第一代有更強的抗腫瘤活性[10，16-17]。第三代CAR-T包含了更多的共刺激分子，以提高T細胞的細胞毒活性、增殖性與存活時間，促進細胞因子的釋放[18](圖1)。第四代CAR(又稱TRUCKs)，是在第三代CAR的基礎上增加了編碼CAR和(或)其反應性啟動子的載體，在轉基因產生的細胞因子作用下CAR產生有效信號，并能夠招募免疫系統其他成員，放大抗腫瘤免疫效應[15，19](圖2)。

3 CAR-T在B系白血病治療中的應用

目前，在CAR-T治療中已經有很多靶抗原，雖然CD19不是最早提出的腫瘤靶抗原，但是目前研究最成熟的，很多臨床試驗都是基于CD19進行研究的。CD19可作為一種理想的靶抗原，因為它可表達在大多數的B細胞惡性腫瘤上，包括B-ALL，CLL等，且不表達在造血干細胞上，即使消除所有的CD19+B細胞，臨床也是可治療的[20]，但潛在的缺陷是CD19的表達不是腫瘤發生所必需的細胞表型，同時表型變異及逃逸也在相關研究中被提到[21-22]。

3.1CAR-T在急性淋巴細胞白血病中的應用 急性淋巴細胞白血病是一類造血干細胞的惡性克隆性疾病。臨床結果顯示，CD19在治療急性淋巴細胞白血病中取得了良好的療效，甚至在復發難治和化療無效的患者中。

圖1 第一、二、三代CAR的結構

圖2 第四代CAR/TRUCK的基本結構

2011年來自MSKCC的Brentjens等[23]首次報道應用CD19-CART治療1例ALL得到完全緩解。然后再次應用CD19CAR-T細胞治療16例復發成人B-ALL[24]，行淋巴細胞清除后輸注CAR-T[25]，CR率達88%(75%MRD-)。所有的患者在輸注后的1～2周CAR-T的數量達到高峰，且在輸注后的2～3月仍可檢測到CAR-T細胞[26]。2015年研究組再次納入33例成人B-ALL，在可評估的32例患者中，CAR-T輸注后CR率達91%，MRD陰性達82%，有趣的是，2例復發的患者CD19陰性。2013年來自賓夕法尼亞大學的Grupp等[27]首次報道應用CD19CAR-T細胞(CTL019細胞)治療2例經異基因造血干細胞移植(allogeneichematopoieticstemcelltransplantation，allo-HSCT)治療后復發難治的前B-ALL患兒，輸注后CTL019細胞在患兒體內擴增超過1 000倍，并可在骨髓及腦脊液中檢測到。輸注后1個月外周血及骨髓CD19陽性細胞均被清除，且獲得骨髓形態學CR，MRD低于0.01%，其中1例基因水平持續緩解達9月，另1例則在緩解2月后復發，但復發后的原始細胞不表達CD19，推測這可能是對CAR-T治療耐藥的原因。2014年Grupp等[21]將病例擴大至30例，其中兒童25例，包括18例allo-HSCT后復發的B-ALL患者，進一步證實了CAR-T細胞治療的良好療效，其CR率高達90%，在外周血、骨髓及腦脊液中均可發現CTL019細胞的擴增。從長期療效看，6個月的無事件生存率(EFS)達67%，總生存率(OS)達78%。NCI研究組運用CD19CAR-T治療20例復發難治的ALL，14例患者達CR(70%)，其中12例MRD陰性，2例在輸注后3～5月復發，檢測發現CD19陰性[28]。2015年歐洲血液學會議上報道，48例ALL患者經CAR-T治療后，可達94%的CR率及72%的DFS(6個月)[29]。

總之，多個研究組提出運用CD19CAR-T治療復發難治的B-ALL取得了良好的療效，在成熟的研究組中取得了88%～94%的CR率，但后期的隨訪很難進行，因為大多數患者在緩解后接受了造血干細胞移植，無法準確評估其治療效果。在未行造血干細胞移植的患者中，部分患者再次復發，首先可能與CD19陰性的白血病細胞有關，表明在治療過程中出現了免疫逃逸；其次，可能與體內CAR-T細胞的缺失有關，表明修飾的T細胞只能暫時地控制腫瘤細胞，而不能達到完全清除。

3.2CAR-T慢性淋巴細胞白血病中的應用CLL是主要發生在中老年的一種B淋巴細胞克隆性增殖的腫瘤性疾病，雖然目前提出很多靶向治療藥物及免疫治療的措施，但除了造血干細胞移植外，耐藥的發生使得其仍是一不可治愈的疾病。目前已有大量的臨床研究證實運用CD19-CART治療復發難治的CLL取得了良好的臨床療效。

2011年Porter等[30]應用第二代CD19-CAR-T細胞治療了3例CLL患者，其中2例CR，1例PR。研究結果顯示，CAR-T細胞不僅能在體內擴增1 000倍以上，而且能在患者外周血和骨髓中保持治療活性達6個月，且發現部分CD19-CAR-T細胞以記憶T淋巴細胞形式存在，存活時間達3年之久，當再次遇到CLL細胞時候能夠快速活化并發揮殺傷作用。2014年Porter等[31]在一項Ⅱ期隨機臨床試驗中提到CD19-CAR-T治療CLL的OS率在35%～57%，所有反應的患者CAR-T在體內的存活時間達到4年。2015年運用CD19-CAR治療14例復發難治的CLL，OS率達57%(8/14)，其中4例CR，4例PR，在反應的這些患者中，CAR-T細胞可存活4年之久，最讓人欣喜的是，CR的4例患者MRD持續陰性達4年之久[32]，此研究結果也被后來的其他學者在類似臨床試驗中得到了驗證。2016年Fraietta等[33]提出在CLL患者中依魯替尼可增強CAR-T的功能及治療活性，因此兩者聯合治療CLL可能得到更好的臨床療效。

目前大多的臨床試驗表明，CAR-T在體內的增殖高峰時間約在輸注后的2周，但在體內的存活時間差異較大，可能與CAR-T的結構有關。對輸注后的CAR-T細胞的免疫表型進行分析，在輸注后的早期可發現少量記憶細胞，在輸注的后期主要以記憶細胞的形式存在[30]，這說明在這些患者中，CAR-T細胞可產生持久的記憶細胞來殺傷腫瘤細胞。有些患者甚至可達4年之久的微小殘留病陰性，有治愈的可能?？傊?，不同的臨床試驗均提出CAR-T治療CLL的有效性，但其都是小樣本，反應率也相差較大，需進一步優化CAR-T的結構使臨床療效得到進一步的改善。

4 相關問題

雖然目前CAR-T是細胞免疫治療研究的熱點，其不僅依賴于CAR-T對于復發難治腫瘤的較高的CR率，還可能與長期的緩解有關，其具有持久的抗腫瘤活性，但最短的緩解時間還未知。目前初始的CR率在不同的研究組不同，因為不同研究組采用不同的T細胞影響CAR的設計，不同的共刺激分子、基因轉染技術、臨床設計以及不同的患者腫瘤負荷，導致臨床結果的差異。同時，因為成人與兒童胸腺功能和T細胞亞群的差異及免疫衰老，這可能解釋了為什么CAR-T在兒童中有更好的療效。

通常CAR-T在CLL患者體內的存活時間長于ALL，但ALL的CR率高于CLL[34]，且相比于ALL的細胞因子釋放綜合征(cytokinereleasesyndrome，CRS)，CLL的嚴重程度明顯低于ALL，這可能有以下幾個原因，首先來源于CLL的CAR-T細胞因為本身T細胞的功能紊亂而導致功能異常[35-36]；其次，需要進一步明確CAR-T進入淋巴結與骨髓的能力是否相同；此外T細胞抑制受體的免疫抑制作用，免疫抑制相關細胞因子的產生，不同類型免疫細胞的產生都可能不同程度地影響CAR-T的療效[37]，使得CLL細胞可能處于抑制CAR-T功能的腫瘤微環境中。還可能與CLL持續表達的抗原特點及其腫瘤生長動力學的差異有關[31]。

對于運用CAR-T治療后的B-ALL再次復發的患者目前仍然是很棘手的問題。CAR-T細胞的活性及持久性的降低導致B-ALL中CD19的原始細胞仍存在，可通過進一步優化CAR-T的設計、基因轉移技術，使產物最大化來發揮殺傷作用，從而進一步提高反應率。第二代及第三代即可通過更強地激發T細胞的持久性而避免了復發。但是對于CD19陰性的原始細胞，其無法通過CA19-CART治療，單一的靶向抗原在腫瘤抗原變異或缺失的時候無法靶向治療。Haso等[38]發現運用CD19-CART治療的B-ALL中，有2例患者的原始細胞CD19陰性，而CD22持續陽性，遂可通過設計CD19-CD22-CART治療這類患者。聯合CD19和CD22設計的CART可能避免腫瘤抗原的變異或缺失所導致的治療無效，但需要進一步的研究。再者，CAR-T治療能否成為異基因造血干細胞移植的橋梁，是一個開放性話題。目前對于復發難治的B-ALL，異基因造血干細胞移植是目前標準治療方案，但因復發難治患者的高腫瘤負荷使得其無法立即行造血干細胞移植，CAR-T可使這些患者達到2次甚至3次緩解，使得患者可再有機會進行移植，從而取得良好療效。

總之，雖然CAR-T免疫治療在B-ALL及CLL患者中取得了較好的療效，但不同研究組之間臨床療效的差異、治療后復發以及治療過程中細胞因子風暴等不良反應的處理仍是CAR-T廣泛應用于臨床前亟需解決的問題。應進一步優化CAR的設計，革新基因轉染技術，選擇理想的效應細胞，同時還需合理的臨床設計，尋求新的腫瘤靶抗原，克服免疫抑制的腫瘤微環境，增強腫瘤組織的趨化功能，增強效應細胞的擴增能力，以進一步提高CAR-T的免疫治療療效，從而為患者提供更大的收益。

[1] 李莉娟，張連生， 細胞免疫治療現狀與前景[J]. 臨床血液學雜志， 2015，28(5):370-373，379.

[2]GhorashianS，PuleM，AmroliaP，CD19chimericantigenreceptorTcelltherapyforhaematologicalmalignancies[J].BrJHaematol， 2015，169(4):463-478.

[3]JenaB，DottiG，CooperLJ.RedirectingT-cellspecificitybyintroducingatumor-specificchimericantigenreceptor[J].Blood， 2010. 116(7):1035-1044.

[4]WestwoodJA，SmythMJ，TengMW，etal.AdoptivetransferofTcellsmodifiedwithahumanizedchimericreceptorgeneinhibitsgrowthofLewis-Y-expressingtumorsinmice[J].ProcNatlAcadSciUSA， 2005，102(52):19051-19056.

[5]AbkenH，HombachA，HeuserC，etal.Anovelstrategyintheeliminationofdisseminatedmelanomacells:chimericreceptorsendowTcellswithtumorspecificity[J].RecentResultsCancerRes， 2001，158:249-264.

[6]ChekmasovaAA，RaoTD，NikhaminY，etal.SuccessfuleradicationofestablishedperitonealovariantumorsinSCID-BeigemicefollowingadoptivetransferofTcellsgeneticallytargetedtotheMUC16antigen[J].ClinCancerRes， 2010，16(14):3594-3606.

[7]LouisCU，SavoldoB，DottiG，etal.Antitumoractivityandlong-termfateofchimericantigenreceptor-positiveTcellsinpatientswithneuroblastoma[J].Blood， 2011，118(23):6050-6056.

[8]MaudeS，BarrettDM.Currentstatusofchimericantigenreceptortherapyforhaematologicalmalignancies[J].BrJHaematol， 2016，172(1):11-22.

[9]SrivastavaS，RiddellSR.EngineeringCAR-Tcells:Designconcepts[J].TrendsImmunol， 2015，36(8):494-502.

[10]AnurathapanU，LeenAM，BrennerMK，etal.EngineeredTcellsforcancertreatment[J].Cytotherapy，2014，16(6):713-733.

[11]EshharZ，WaksT，GrossG，etal.Specificactivationandtargetingofcytotoxiclymphocytesthroughchimericsinglechainsconsistingofantibody-bindingdomainsandthegammaorzetasubunitsoftheimmunoglobulinandT-cellreceptors[J].ProcNatlAcadSciUSA， 1993，90(2):720-724.

[12]FinneyHM，AkbarAN，LawsonAD.ActivationofrestinghumanprimaryTcellswithchimericreceptors:costimulationfromCD28，induciblecostimulator，CD134，andCD137inserieswithsignalsfromtheTCRzetachain[J].JImmunol， 2004，172(1):104-113.

[13]PuleMA，StraathofKC，DottiG，etal.AchimericTcellantigenreceptorthataugmentscytokinereleaseandsupportsclonalexpansionofprimaryhumanTcells[J].MolTher， 2005，12(5):933-941.

[14]ZhongXS，MatsushitaM，PlotkinJ，etal.Chimericantigenreceptorscombining4-1BBandCD28signalingdomainsaugmentPI3kinase/AKT/Bcl-XLactivationandCD8+Tcell-mediatedtumoreradication[J].MolTher， 2010，18(2):413-420.

[15]DaiH，WangY，LuX，etal.ChimericantigenreceptorsmodifiedT-cellsforcancertherapy[J].JNatlCancerInst， 2016，108(7).

[16]HolohanDR，LeeJC，BluestoneJA.ShiftingtheevolvingCARTcellplatformintohighergear[J].CancerCell， 2015，28(4):401-402.

[17]ZhangT，CaoL，XieJ，etal.EfficiencyofCD19chimericantigenreceptor-modifiedTcellsfortreatmentofBcellmalignanciesinphaseIclinicaltrials:ameta-analysis[J].Oncotarget，2015，6(32):33961-33971.

[18]KarlssonH，SvenssonE，GiggC，etal.Evaluationofintracellularsignalingdownstreamchimericantigenreceptors[J].PLoSOne， 2015，10(12):e0144787.

[19]ChmielewskiM，HombachAA，AbkenH.OfCARsandTRUCKs:chimericantigenreceptor(CAR)Tcellsengineeredwithaninduciblecytokinetomodulatethetumorstroma[J].ImmunolRev， 2014，257(1):83-90.

[20]ScheuermannRH，RacilaE.CD19antigeninleukemiaandlymphomadiagnosisandimmunotherapy[J].LeukLymphoma，1995，18(5-6):385-397.

[21]MaudeSL，FreyN，ShawPA，etal.ChimericantigenreceptorTcellsforsustainedremissionsinleukemia[J].NEnglJMed， 2014，371(16):1507-1517.

[22]EvansAG，RothbergPG，BurackWR，etal.EvolutiontoplasmablasticlymphomaevadesCD19-directedchimericantigenreceptorTcells[J].BrJHaematol， 2015.

[23]BrentjensRJ，RiviereI，ParkJH，etal.SafetyandpersistenceofadoptivelytransferredautologousCD19-targetedTcellsinpatientswithrelapsedorchemotherapyrefractoryB-cellleukemias[J].Blood，2011，118(18):4817-4828.

[24]BrentjensRJ，DavilaML，RiviereI，etal.CD19-targetedTcellsrapidlyinducemolecularremissionsinadultswithchemotherapy-refractoryacutelymphoblasticleukemia[J].SciTranslMed， 2013，5(177):177ra38.

[25]DavilaML，RiviereI，WangX，etal.Efficacyandtoxicitymanagementof19-28zCARTcelltherapyinBcellacutelymphoblasticleukemia[J].SciTranslMed， 2014，6(224):224ra25.

[26]MillerBC，MausMV.CD19-targetedcarTcells:anewtoolinthefightagainstBcellmalignancies[J].OncolResTreat， 2015，38(12):683-690.

[27]GruppSA，KalosM，BarrettD，etal.Chimericantigenreceptor-modifiedTcellsforacutelymphoidleukemia[J].NEnglJMed， 2013，368(16):1509-1518.

[28]LeeDW，KochenderferJN，Stetler-StevensonM，etal.TcellsexpressingCD19chimericantigenreceptorsforacutelymphoblasticleukaemiainchildrenandyoungadults:aphase1dose-escalationtrial[J].Lancet， 2015，385(9967):517-528.

[29]GruppSA，MaudeSL，ShawP，etal.Tcellsengineeredwithachimericantigenreceptor(CAR)targetingCD19 (CTL019)havelongtermpersistenceandinducedurableremissionsinchildrenwithrelapsed，refractoryall[J].Blood， 2014，124(21):380-380.

[30]KalosM，LevineBL，PorterDL，etal.Tcellswithchimericantigenreceptorshavepotentantitumoreffectsandcanestablishmemoryinpatientswithadvancedleukemia[J].SciTranslMed， 2011，3(95):95ra73.

[31]PorterDL，FreyNV，MelenhorstJJ，etal.Randomized，phaseⅡdoseoptimizationstudyofchimericantigenreceptormodifiedtcellsdirectedagainstcd19 (ctl019)inpatientswithrelapsed，refractorycll[J].Blood， 2014，124(21):1982-1982.

[32]PorterDL，HwangWT，FreyNV，etal.ChimericantigenreceptorTcellspersistandinducesustainedremissionsinrelapsedrefractorychroniclymphocyticleukemia[J].SciTranslMed， 2015，7(303):303-139.

[33]FraiettaJA，BeckwithKA，PatelPR，etal.IbrutinibenhanceschimericantigenreceptorT-cellengraftmentandefficacyinleukemia[J].Blood，2016，127(9):1117-1127.

[34]BrownJR，PorterDL，O'BrienSM.Noveltreatmentsforchroniclymphocyticleukemiaandmovingforward[J].AmSocClinOncolEducBook， 2014:e317-25.

[35]ChristopoulosP，PfeiferD，BartholomeK，etal.DefinitionandcharacterizationofthesystemicT-celldysregulationinuntreatedindolentB-celllymphomaandveryearlyCLL[J].Blood， 2011. 117(14):3836-3846.

[36]RichesJC，DaviesJK，McClanahanF，etal.TcellsfromCLLpatientsexhibitfeaturesofT-cellexhaustionbutretaincapacityforcytokineproduction[J].Blood， 2013. 121(9):1612-1621.

[37]Saulep-EastonD，VincentFB，QuahPS，etal.TheBAFFreceptorTACIcontrolsIL-10productionbyregulatoryBcellsandCLLBcells[J].Leukemia， 2016，30(1):163-172.

[38]HasoW，LeeDW，ShahNN，etal.Anti-CD22-chimericantigenreceptorstargetingB-cellprecursoracutelymphoblasticleukemia[J].Blood， 2013，121(7):1165-1174.

張連生，Email:zhangliansheng@medmail.com.cn

R

A

1004-583X(2017)04-0347-05

10.3969/j.issn.1004-583X.2017.04.019

2017-02-14 編輯:武峪峰