馬尾松種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析

李元應(yīng)

摘要 以35份馬尾松種質(zhì)資源為材料，研究馬尾松嫩梢基因組DNA提取的最適方法；建立并優(yōu)化馬尾松ISSR反應(yīng)體系；采用ISSR標(biāo)記，結(jié)合聚類分析，對(duì)我國馬尾松種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：16條引物共擴(kuò)增出153個(gè)條帶，多態(tài)位點(diǎn)136個(gè)，每個(gè)引物檢測(cè)到的條帶數(shù)介于6～14之間；根據(jù)35份馬尾松各資源的遺傳系數(shù)進(jìn)行聚類，可將35份資源劃分為4個(gè)大類，即福建邵武、浙江仙居、江西德興、福建連城各為1類，其余31份資源為1大類。

關(guān)鍵詞 馬尾松； ISSR；聚類分析；遺傳多樣性

中圖分類號(hào) S791.248 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2017）04-0123-02

Abstract Using 35 accessions of Pinus massoniana as materials，optimum method of genomic DNA extracted from Pinus massoniana tender tip was studied，the ISSR reaction system was established and optimized，genetic diversity of Pinus massoniana was studied by ISSR markers and clustering analysis. The results showed that 16 primers amplified 153 bands among which had polymorphic loci 136，the percentage of polymorphic loci was 88.9%. The number of bands per primer detected among 6～14.According to the genetic coefficient，35 resources could be divided into 4 categories，namely Fujian Shaowu，Zhejiang Xianju，Jiangxi Dexing，F(xiàn)ujian Liancheng，the rest of the 31 resource for 1 categories..

Key words Pinus massoniana；ISSR；clustering analysis；genetic diversity

ISSR是一種用于構(gòu)建PCR為基礎(chǔ)的分子圖譜的分子標(biāo)記技術(shù)。為了揭示馬尾松種源遺傳多樣性，本研究擬采用ISSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)35份馬尾松資源的遺傳多樣性進(jìn)行分析，以期揭示不同馬尾松種源在DNA上的差異性[1-2]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的35份馬尾松資源均由福建省三明市大田縣桃源國有林場(chǎng)種源試驗(yàn)基地提供，于2015年3月采其剛抽生的嫩梢，用冰塊冷藏，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后置-20℃冰箱中保存，用于提取基因組DNA。35份馬尾松資源編號(hào)及原產(chǎn)地見表1。

1.2 試驗(yàn)試劑

dNTPs（dNTP Mix）、Taq DNA聚合酶、CTAB、EDTA、Tris-HCl、β-巰基乙醇、PVP、瓊脂糖、100 bp DNAladde Marker。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA的提取與檢測(cè)。參照Salah M等[3]提取植物基因組DNA的CTAB法，在此基礎(chǔ)上，參考文獻(xiàn)[4]對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)。將提取的DNA樣品中取出10 μL，稀釋到1 000 μL，吸取適當(dāng)體積上樣于1%瓊脂糖凝膠，在4～5 V/cm電泳儀中電泳15～20 min，干凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照，根據(jù)電泳條帶判斷DNA[5]質(zhì)量。

1.3.2 ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)與引物篩選。參照羅曉瑩等[6]的研究結(jié)果，構(gòu)建基礎(chǔ)反應(yīng)體系：即25 μL反應(yīng)體系，內(nèi)含25 ng模板DNA、2.5 mmol/L MgCl2、0.8 μmol/L引物、1×Buffer緩沖液、0.16 mmol/L dNTPs、1UTaqDNA聚合酶。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，特定溫度下退火45 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，退出。

隨機(jī)抽取一份DNA為模板，以Mg2+濃度、引物濃度、dNTP 濃度、DNA 模板濃度、aq DNA 聚合酶作為優(yōu)化因子，以 UBC857（5′-（AC）8YG-3′）作為優(yōu)化引物對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠于3 V/cm電場(chǎng)中電泳，染色，觀察并拍照。然后分別于50 、52、54 、55、56、58 、60 ℃溫度下退火篩選引物，各引物Tm值計(jì)算公式如下：

Tm=2×（A+T） +4×（G+C）

式中，A、T、G、C為各堿基的堿基數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離、染色顯示后進(jìn)行譜帶觀察、統(tǒng)計(jì)，對(duì)于同一引物的擴(kuò)增產(chǎn)物，遷移率相同的條帶記為1個(gè)位點(diǎn)，擴(kuò)增陽性、陰性的賦值分別為1、0，利用Excel 2000建立原始表征數(shù)據(jù)矩陣[7-8]，利用SPSS 11.5軟件構(gòu)建35份馬尾松資源聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系與反應(yīng)程序的確立

經(jīng)研究[9]確定最優(yōu)的ISSR-PCR的擴(kuò)增體系如下：在總體積25 μL的擴(kuò)增反應(yīng)中，包含50 ng模板DNA、2.5 mmol/L MgCl2、0.5 μmol/L引物、0.2 mmol/L dNTP、 1.0 UTaq DNA 聚合酶、1×Buffer緩沖液。引物擴(kuò)增程序同1.3.2，4 ℃保存。

2.2 ISSR引物篩選結(jié)果及擴(kuò)增結(jié)果分析

從60條引物中篩選出16條擴(kuò)增條帶較多、信號(hào)強(qiáng)、背景清晰的引物用于ISSR-PCR反應(yīng)，各引物序列及擴(kuò)增情況見表2。可以看出，在檢測(cè)到的153個(gè)條帶中，有多態(tài)位點(diǎn)的達(dá)136個(gè)，占比88.9%。每條引物檢測(cè)到的條帶數(shù)在6～14個(gè)之間，平均為9.6個(gè)；有多態(tài)位點(diǎn)的條帶數(shù)在6～13個(gè)，平均為8.5個(gè)。擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度在200～4 000 bp之間，UBC827ISSR擴(kuò)增譜帶見圖1。其中，擴(kuò)增位點(diǎn)最多的是引物UBC855，其擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)為14；其次為UBC840，擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)13；最少的是引物UBC846、UBC850和UBC881，均有6條清晰條帶。

2.3 馬尾松ISSR遺傳多樣性的聚類分析

利用SPSS 11.5的聚類分析功能計(jì)算35份馬尾松資源的遺傳相似系數(shù)（GS）。結(jié)果表明，35份供試樣品之間的GS值平均為0.503。其中，福建三明和福建閩清之間的GS值最大，為1，說明兩者之間的遺傳基礎(chǔ)相似。湖北紅安與湖南常寧的GS值為0.936、福建武平與福建永安的GS值為0.924、湖南慈利與江西靖江的GS值為0.891、安徽屯溪與安徽潛山之間的GS值為0.871，均>0.87，說明它們之間的基因組組成和核苷酸序列比較相似。而福建邵武與湖南江永和江西靖江的GS值均為0，即遺傳距離為1，表明它們的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。福建邵武與其他34份樣品的GS值均在0.357以下，且僅與2個(gè)樣品間相似系數(shù)>0.3，說明其與其他樣品間的差異較大[10-13]。

遺傳相似系數(shù)的結(jié)果利用SPSS 11.5做出聚類樹型圖，聚類結(jié)果見圖2。在D=0.41處做第一等級(jí)劃分，可將35份樣本分為1個(gè)大類和4個(gè)獨(dú)立的個(gè)類，即福建邵武、浙江仙居、江西德興、福建連城各自聚為1類，其余31份樣品聚為1大類；在D=0.55處做第二等級(jí)劃分，可將35份樣本分為1個(gè)大類群、2個(gè)小類和7個(gè)獨(dú)立的個(gè)類。第一大類有福建三明、福建閩清、湖南江永、江西靖江、湖南綏寧、江西萬載、安徽屯溪、安徽潛山、湖南慈利、四川涪陵、陜西城固、湖北紅安、湖南常寧、廣西忻城、福建武平、福建漳平、湖南臨湘、浙江嵊縣、浙江慶元、廣東韶關(guān)、廣西恭城、廣東羅定、貴州貴陽；貴州黃平和貴州都勻聚為一小類；江西武寧和廣東廣寧聚為另一小類；福建邵武、四川南江、浙江仙居、江西德興、江西余江、貴州都勻、湖北遠(yuǎn)安則為7個(gè)獨(dú)立的個(gè)類[10-13]。

3 結(jié)論與討論

經(jīng)ISSR-PCR的擴(kuò)增體系共篩選出16條ISSR引物，用其對(duì)35份馬尾松樣品進(jìn)行擴(kuò)增，在檢測(cè)到的153個(gè)條帶中，有多態(tài)位點(diǎn)的達(dá)136個(gè)，占比88.9%，且每個(gè)引物檢測(cè)到的條帶數(shù)介于6～14之間，證明ISSR可以準(zhǔn)確分析馬尾松種源的遺傳多樣性。

基于35份馬尾松資源的遺傳系數(shù)，35份資源可劃分出4個(gè)大類，即福建邵武、浙江仙居、江西德興、福建連城各自聚為1類，其余31份樣品聚為1大類。這表明，親緣關(guān)系與緯度相關(guān)，劃分類群與地理起源明顯相關(guān)；品種之間遺傳背景相似，劃分的類群與原產(chǎn)地相關(guān)性很高，說明與其他地區(qū)馬尾松品種間基因交流較少，在長(zhǎng)期栽培過程中以經(jīng)濟(jì)性狀、抗性等用途為目標(biāo)的地域之間的品種交換并不頻繁[10-13]。在以后的試驗(yàn)中，除了考慮各種源原產(chǎn)地的緯度外，還要加大種源采樣的密度，促使試驗(yàn)更完善。

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