采用Percoll液純化分離貯精腺細胞試驗

徐鑫

摘要 以新揚州雞為素材，用膠原酶/透明質酸酶和各梯度濃度的Percoll液的方法分離子宮陰道交接處（UVJ）的貯精腺細胞并進行細胞培養以達到細胞純化的目的，旨在建立雞貯精腺細胞純化分離和培養技術，為進一步研究和分析貯精腺的構造和功能，以及調控機理的研究提供技術平臺。結果表明：用膠原酶/透明質酸酶分離培養，消化45 min，100目過濾的貯精腺細胞用Percoll液原代培養至少存活120 h，細胞的純化效果很明顯。

關鍵詞 新揚州雞；Percoll液；透明質酸酶；貯精腺；純化；細胞培養

中圖分類號 Q50 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）04-0233-01

動物細胞培養開始于20世紀初，到1962年規模開始擴大，發展至今已成為醫學、生物研究和應用中廣泛采用的技術方法，具有重要醫用價值的酶、生長因子、疫苗和單抗等可通過利用動物細胞培養生產，這已成為醫藥生物高技術產業的重要部分[1]。

動物細胞雖可像微生物細胞一樣，在人工控制條件的生物反應器中進行大規模培養，但其細胞結構和培養特性與微生物細胞相比有顯著差別：①動物細胞比微生物細胞大得多，無細胞壁，機械強度低，對剪切力敏感，適應環境能力差；②培養過程需氧量少；③倍增時間長，生長緩慢，易受微生物污染，培養時須用抗生素；④原代培養細胞一般繁殖50代即退化死亡；⑤培養過程中細胞相互粘連以集群形式存在；⑥代謝產物具有生物活性，生產成本高，但附加值也高[1-5]。

Percoll是一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒。滲透壓很低（<20 mosm/kg H2O），黏度也很小，可形成高達1.3 g/mL密度，采用預先形成的密度梯度時可在低離心力[（200～1 000）g]于數分鐘至數十分鐘內達到滿意的細胞分離結果[6-9]。由于Percoll擴散常數低，所形成的梯度十分穩定[10-15]。此外，Percoll不穿透生物膜，對細胞無毒害，因而廣泛用于分離細胞、亞細胞成分、細菌及病毒，還可將受損細胞及其碎片與完好的活細胞分離[16]。

家禽輸卵管由漏斗部、膨大部、峽部、子宮部和陰道部組成[11]，陰道部較短，呈“S”狀彎曲，其中子宮陰道交接部存在一種特殊的管狀腺，該腺體由單層柱狀上皮細胞構成，腺管細胞頂部無纖毛，細胞核排列整齊，位于細胞的基部，因精子在此貯存而被稱為貯精腺[12]，貯精腺的存在使禽類精子在輸卵管內可以長期存活，一般為2～3周，并能長時間保持受精能力[12-13]。本次試驗用新揚州雞為素材，用膠原酶/透明質酸酶消化分離子宮陰道交接處（UVJ）的貯精腺細胞[16-19]，并用各梯度濃度的Percoll液純化貯精腺細胞，旨在建立雞貯精腺細胞純化分離和培養技術，為貯精腺調控機理的研究提供技術平臺。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用4只處于盛產期的新揚州雞貯精腺為素材，采用膠原酶/透明質酸酶消化分離子宮陰道交接處（UVJ）的貯精腺細胞，并用各梯度濃度的Percoll液純化貯精腺細胞[20-24]。

試驗儀器和試驗試劑有無菌室和無菌操作臺，體視顯微鏡，天平（稱量所取組織或黏膜），離心機，臺式天平（離心時平衡用），鋁盒1個（盛器皿），大瓷盤1個（采樣用），小瓷盤1個（裝冰用），大剪刀1把（剖雞），解剖剪2把（剪子宮陰道部），解剖刀2把，眼科剪2把（將組織剪成小塊），小鑷子4 把，小培養皿6個，西林瓶6個，廢液瓶1個（500 mL燒杯代替），100目過濾篩1個，0.1%明膠預處理過的4孔細胞培養板若干個，吸管20支，50～100 mL三角瓶（或稱錐形瓶）2個，10 mL試管2個（套帽），紅血球計數板，載玻片，蓋玻片，1 000、100、10 μL槍各1把，10 mL試管8個（套帽）。膠原酶/透明質酸酶無菌PBS（pH值7.2～7.4），DMEM 培養液，滅活血清，酒精棉，慶大霉素1支，臺盼藍染液。各梯度濃度的 Percoll。

1.2 試驗方法

膠原酶/透明質酸酶、培養液DMEM、碎冰入無菌室內，無菌室和無菌操作臺用紫外線消毒0.5～1.0 h。酒精棉消毒大瓷盤、大剪刀、鑷子、解剖剪各1把入解部室，用時再酒精燈消毒。慶大霉素1支（80萬U）入消過毒的PBS。雞固定于大瓷盤，大剪刀剖1只雞腹，暴露生殖道，用鑷子夾住子宮陰道部，解剖剪剪下UVJ入含PBS的培養皿。縱剖UVJ，并縱向分成2個部分，入無菌室。洗滌入另一PBS培養皿，去結締組織。無菌操作臺內解剖剪剪碎，入含PBS培養皿。無菌操作臺內將樣品、吸管用酒精燈消毒。用吸管吹打樣品管，吸PBS入廢液瓶。換吸管并用酒精燈消毒。用吸管加膠原酶/透明質酸酶20 mL入三角瓶，加5 mL DMEM。置37 ℃水浴鍋內振蕩消化45 min，入碎冰盤終止消化。同時做4個梯度離心管：滅活血清將10 mL離心管潤洗1次，每個離心管用1 000 μL槍依次取1 mL 70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%的Percoll液入10 mL離心管（注意離心管內Percoll液體從底部至頂部依次從高濃度到低濃度，各層不得相互混合）。100目過濾入三角瓶，吸管吸入10mL離心管，蓋帽，1 000 r/min 7～8 min，灑精棉擦離心管外壁四周，無菌操作臺內消毒試管，上清液入廢液瓶，換吸管并用酒精燈消毒[25-26]。下層細胞用DMEM稀釋（用1 mL槍吸DMEM培養基入試管，總用量為5 mL）。先取DMEM入1個試管，吸打并移入另一試管，兩者混合吹打均勻成細胞懸液。在4個梯度離心管頂層加1 mL分離的細胞液，蓋帽。從超凈臺內取出。以1 400～2 500 r/min離心25 min。100 μL槍收集每層細胞置10 mL離心管，加5倍（下轉第236頁）

（上接第233頁）

體積PBS洗滌，以1 000 r/min離心10 min。重復洗滌1次。加1 mL DMEM重懸細胞。用槍取10 μL細胞至載玻片，用體視顯微鏡觀察，照相；10 μL樣于10 μL 0.4%臺盼藍染色，計數死活細胞數。 細胞原液、各層純化的細胞調整密度至3×106個/mL，4孔培養板培養。板孔底部最好不要有氣泡，可用吸管將氣泡吸出，蓋上瓶蓋。標記日期及樣品名稱，移至38.5 ℃的CO2培養箱，進行細胞培養。

2 結果與分析

試驗結果表明，膠原酶/透明質酸酶，Percoll液純化分離，消化45 min，100目過濾的貯精腺細胞的細胞純度很高（圖1），基本都是所需要的細胞，細胞數目多，完整性好，貼壁效果好，比沒用Percoll液分離的效果更加明顯更清楚，更加有利于進一步分離培養。

3 結論與討論

密度梯度離心技術是早期應用的一種細胞分離、純化的方法，是Brakke于1951年提出來的，其基本原理是利用離心溶液介質所形成的密度梯度來維持重力的穩定性和抑制對流，待分離顆粒的密度在離心溶液的梯度柱密度范圍內，經過一定時間離心后，不同密度的顆粒分別集中在離心溶液某密度帶上而得以分離[16]。Percoll細胞分離液是一質優的分離介質，與Ficoll相比其黏度低、穩定，對細胞無毒害作用，顆粒大易于從細胞表面洗脫下來，更重要的是Percoll在高速離心（>10 000 r/min）時可產生連續梯度，利用這一特點先處理細胞懸濁液，光鏡下幾乎沒見到細胞間的聚集。Percoll液顆粒大小不一，離心后可形成一定的密度梯度，不同密度的細胞分布于不同密度的層內，借此可將貯精腺細胞和雜細胞及細胞碎片分離。本試驗利用Percoll密度梯度離心法快速穩定，而且便于提純和體外培養，細胞成活率高，取得了比較滿意的效果。

本試驗結果表明，用Percoll細胞分離液和膠原酶/透明質酸酶分離貯精腺細胞的效果非常明顯，純度很高，并且分離出的細胞繼續培養的效果也很好，這2種試劑組合有利于細胞的分離培養，為進一步研究貯精腺的機理奠定了基礎。

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