貝類三倍體育種研究進展

孫秀鵬

摘要 綜述了貝類三倍體育種的原理、方法、影響因素。在分析國內外研究現狀的基礎上，展望了貝類三倍體育種未來的發展方向。

關鍵詞 貝類；三倍體；育種；原理；方法；影響因素；意義

中圖分類號 S968.3 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）04-0234-03

Abstract This article introduced principles，methods and influencing factors of shellfish triploid breeding.It analyzed the research status at home and abroad，and then put forward essential research considerations related to shellfish triploid breeding.

Key words shellfish；triploid；breeding；principle；method；influencing factor；singificance

貝類具有食物鏈短、定居性強、養殖和育苗技術完善、養殖成本低等優點，是我國海水養殖的主要種類之一。貝類養殖已成為我國沿海經濟發展的主要支柱之一[1]。近年來，貝類養殖研究的熱點是利用細胞遺傳學技術對貝類的品種進行改良，提升貝類養殖產品的品質和產量。貝類三倍體育種技術通過改變貝類染色體組的方式來改變其遺傳基礎，使其個體大小、生長速度、抗病能力等形態特點優于普通二倍體個體，遺傳特性優良[2-3]。由此，在國內廣泛開展對貝類的三倍體育種的研究。

1 貝類三倍體產生的機理

貝類在自然條件下多為二倍體，細胞內含有2組染色體組。研究表明，絕大多數貝類在性成熟后排放出的精子已經完成2次減數分裂，每個精子中只含有個體細胞中1/2的染色體數，而排出的成熟卵子一般停留在第一次減數分裂的前期或中期，只有在受精或者其他因素刺激后，卵子才會完成2次減數分裂釋放出第一極體和第二極體，隨后進入卵裂。貝類卵子減數分裂的延遲現象為貝類三倍體育種提供了條件[4-7]。

獲得貝類三倍體的途徑主要有2種：一種方式是將二倍體貝類和四倍體貝類進行雜交，從理論上可以100%得到三倍體個體[8-10]；另一種是抑制受精卵第一極體或第二極體的釋放，使極體內所含的1組染色體保留在受精卵內，受精卵的染色體增加1組形成三倍體[11-15]。

2 三倍體育種方法

2.1 物理方法

2.1.1 靜水壓。靜水壓法是使用水靜壓設備對處理對象施加壓力，抑制其紡錘體的微絲、微管的形成，抑制細胞分裂，抑制極體排出。200～500 kg/s是靜水壓處理常用的壓力范圍，處理時間約為10 min，根據物種不同而有所變化[12]。

2.1.2 溫度休克。溫度休克改變細胞內酶的構型，使細胞內酶促反應的進行受到影響，導致細胞分裂過程中所需的ATP供應途徑受阻，使完成減數分裂染色體加倍的細胞不能分裂。溫度休克分為熱休克和冷休克，所處理的溫度因物種不同而有所不同，一般在該物種生存溫度范圍的上下限[11，16-21]。

2.1.3 低滲。低滲法通過降低受精卵所處的海水鹽度進行誘導，導致細胞內能量代謝紊亂，微絲、微管形成受到影響[22-24]，細胞分裂受到抑制。此方法成本低、操作簡單、誘導率高，適宜在生產中使用[13]。

此外，還有通過對受精卵施加電脈沖誘導形成三倍體的方法。

2.2 化學法

化學法是在受精卵發育的適當時期使用化學藥品進行誘導，使其在第一極體或第二極體釋放時受到抑制，從而形成三倍體個體。6-二甲氨基嘌呤（6-dimethylamintpurin，簡稱6-DMAP）、細胞松弛素B（CytochalasinB，簡稱CB）、秋水仙素、咖啡因等為常用試劑。這些藥物作用的機理不同但都能誘導受精卵抑制正常的細胞分裂形成三倍體[25-28]。

2.2.1 6-二甲氨基嘌呤（6-dimethylamintpurin，簡稱6-DMAP）。6-DMAP是嘌呤毒素的一種類似物，通過作用于細胞內特定激酶，破壞細胞微管的聚合中心，抑制極體的釋放[7，29-31]。6-DMAP易溶于水，低毒，無致癌性，價格低廉且誘導高效，最近在貝類多倍體誘導中代替細胞松弛素B被廣泛應用[8]。6-DMAP的適宜濃度范圍為300～450 μmml/L，處理時間10～20 min[9]。

2.2.2 細胞松弛素B（CytochalasinB，簡稱CB）。細胞松弛素B是真菌的代謝產物之一，該藥物可特異性地作用于細微絲，導致細胞微絲和肌球蛋白構成的“收縮環”解體，阻止細胞分裂從而抑制極體釋放，產生三倍體。細胞松弛素B有劇毒，使用其產生三倍體是通過破壞受精卵的細胞結構而完成的，經過細胞松弛素B處理的受精卵三倍體率很高，也會使處理過的受精卵孵化率降低[5-6]。細胞松弛素B的有效濃度為0.2～1.0 mg/L，一般溶解在二甲基亞砜中使用，處理時間10～15 min[6]。

2.2.3 秋水仙素。秋水仙素能夠抑制微管的合成，使已有的微管解聚，阻止紡錘體形成[22]，三倍體得以誘導形成。此藥物在植物中應用廣泛，但在貝類及其他動物中應用較少。

2.2.4 咖啡因?？Х纫蛲ㄟ^提高受精卵細胞內的Ca2+濃度，使對Ca2+濃度極其敏感的微管受到破壞，紡錘絲的形成受到影響，從而抑制細胞分裂形成三倍體。咖啡因的有效濃度、處理時間分別為5～15 mmol/L、10～15 min?？Х纫蚝蜔嵝菘颂幚矸ńY合使用誘導效果更加顯著[10，22]。

2.2.5 其他藥劑。三氯甲烷、氯化鈣、聚乙烯乙二醇等藥物對抑制細胞分裂形成三倍體都有一定的作用，但誘導效果較差，很少采用。

2.3 生物學方法

理論上將二倍體貝類和四倍體貝類進行雜交，可以100%得到三倍體個體。此方法操作簡便、三倍體率高、避免了理化處理對受精卵的損傷，是理想的產業化養殖育種方式[14]。

此外，人工雌核發育和細胞融合法也可以用于誘導貝類三倍體。

3 影響貝類三倍體育種的因素

影響貝類三倍體育種的因素主要有受精卵處理條件的確定、受精卵發育的同步性和受精卵的密度。

3.1 受精卵的處理條件

多倍體育種過程中，有效的誘導途徑和處理時間是育種成功的關鍵。選擇適當的誘導途徑，以能夠抑制極體釋放的最小劑量處理受精卵，可以有效地減小外界處理對受精卵造成的影響。在此基礎上對受精卵的發育過程進行詳細研究以確定其極體釋放的時間點，確定誘導條件的處理時間。綜合一定范圍內誘導途徑與處理時間結果的的差異，決定對同一物種誘導率、幼蟲成活率最高的一組條件[15]。

3.2 受精卵發育的同步性

多倍體人工育種是對處于某一特定發育階段的受精卵進行處理，因而被處理的受精卵之間保持同步性是高效誘導三倍體的關鍵。受精卵發育的同步性主要與卵子的質量、受精卵發育的溫度有關。闕華勇等[17]發現近江牡蠣在25～28 ℃時受精卵發育同步性較高。Uttin等[16]發現菲律賓蛤仔卵的質量與卵子的脂類儲量相關，提高卵子的脂類儲量有助于增強卵子對CB處理造成傷害的承受能力。

3.3 受精卵密度

在誘導過程中，提高受精卵的密度可以減少誘導用的藥物劑量，但卵細胞密度過高會使卵子沉積于容器底部，影響藥物與卵細胞的相互作用，降低誘導率[18]。

4 貝類三倍體育種的意義

三倍體細胞是非偶數染色體組，無法正常產生生殖細胞，從而導致個體性腺發育不良或無法發育。不育的三倍體不像正常個體在性成熟階段發育性腺消耗能量，使個體將更多的能量用于生長。三倍體不育的特點可以使其在生產過程中達到如下目的：①控制貝類養殖過程中的過速繁殖，防止干擾天然資源。②獲得生長速度快的三倍體個體，有助于提高經濟效益[22]。③通過對二倍體種間雜交不成功的2個良種貝類進行三倍體誘導雜交，整合其優良性狀，如溫度耐受性、抗病性、生長快速性等。

5 貝類三倍體育種研究進展

關于貝類三倍體研究自1981年Stanley等[19]報道了人工誘導美洲牡蠣三倍體成功以來，取得了快速發展，目前已在30余種貝類中開展了多倍體育種的研究。尤其在近幾年，隨著對多倍體育種操作的研究深入，一些三倍體貝類在人工養殖過程中表現出多種優良性狀。部分三倍體育種技術已經應用于商業化生產，如三倍體牡蠣于美國的產業化。我國貝類三倍體育種項目雖然開展較晚，但在國家863項目支持下，在櫛孔貝類、皺紋盤鮑等貝類上開展了研究工作，目前一些種類已經初具產業化規模。

6 貝類三倍體育種研究展望

貝類養殖是我國海水養殖的支柱產業之一，但由于長期以來，養殖貝類由于近親繁殖、養殖環境污染以及疾病等原因造成了產量的下降，嚴重影響其快速健康發展。因而希望通過三倍體育種技術培育出生長迅速、抗逆性強的品種，改善貝類養殖業所面臨的問題。

我國在貝類三倍體育種方面已經進行了大量的研究并取得了長足進步，但還存在著一些問題。誘導方法上，化學方法誘導效果好，但成本高、具有毒性，對貝類及養殖周邊環境都有影響；物理方法操作簡單、成本低廉，但誘導效果不好；生物方法所應用的貝類四倍體培育和細胞融合技術仍是一個難題。因此，尋找一種高效、無毒、安全且低成本的貝類三倍體育種方法是今后貝類育種的主要研究方向。

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