重組蛋白純化研究進展

蔣世強　潘能慶　鄢航

摘要 隨著基因工程技術的快速發展，重組蛋白表達技術越來越成熟，然而重組蛋白的分離純化技術相對落后限制了重組蛋白的應用。本文著重介紹了目前重組蛋白分離純化的主要技術及其特點和應用范圍。

關鍵詞 重組蛋白；分離；純化

中圖分類號 Q513 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）04-0250-02

Abstract With the rapid development of genetic engineering technology，the expression of recombinant protein is more and more mature，but the relatively backward technique of separation and purification of recombinant protein limits its application.This review focused on introducing the technique of separation and purification of recombinant proteins and its characteristics and application scope.

Key words recombinant protein；separation；purification

近年來，基因工程技術的突飛猛進，使得醫學基礎學科發生了根本性的變化，也快速促進了生物醫藥行業的發展。目前，有不少通過基因工程技術開發的生物醫藥已經處于研發后期，更有些藥物的研發已經進入應用階段。盡管很多不同種類的蛋白通過基因工程技術在體外成功表達，然而在基因工程下游工作中的蛋白純化技術還不夠成熟，據有人統計，基因工程產品的分離純化成本約占到其全部成本的60%～80%[1]。因此，基因工程技術的下游工程中的基因重組蛋白的分離純化技術將成為目前醫藥開發的瓶頸，也是未來最具有潛力的突破方向，更是生物醫藥商業化必須攻克的難題。

1 蛋白分離純化的原理

目前，對于基因工程技術生產的重組蛋白的純化方法有很多，按照大類可分為沉淀技術、層析技術、雙液相萃取技術等。不管是哪一種方法，其分離純化的原理都是利用其物理和化學性質的差異，物理性質包括分子的大小、形狀、溶解度，化學性質包括等電點、疏水性以及與其他分子的親和性等性質。根據目標蛋白的物理或化學性質的不同，可以有針對性地采取不同的分離純化方法（表1）。

2 沉淀技術

沉淀技術是比較傳統的蛋白分離純化方法，具有成本低、操作簡單、回收率高、設備要求低的優點。然而該方法對蛋白的選擇性不高，適用于蛋白的初步純化和濃縮。該技術主要可以分為鹽沉淀法、有機沉淀法、等電點沉淀法。

2.1 鹽沉淀法

鹽沉淀法是最常用的蛋白沉淀方法，其原理是利用鹽離子的水化作用使蛋白表面的水化層破壞，疏水區暴露，蛋白由于疏水作用面發生沉淀。不同的蛋白在不同鹽濃度下析出，因而可以通過緩慢改變鹽的濃度使不同的蛋白分級沉淀，達到分離純化目的。在鹽沉淀方法中，最常用于沉淀的鹽是硫酸銨，其優點有價格便宜、溶解度大、溫度影響小、對蛋白的活性影響小。

2.2 有機沉淀法

有機沉淀法是利用有機溶劑降低水活度，破壞蛋白表面水化膜，引起蛋白的沉淀。該方法的優點是有機溶劑易分離，能使蛋白快速脫鹽與濃縮，但是容易升溫造成蛋白變性，因此需要在低溫下操作[2]。常用于沉淀蛋白的有機溶劑有丙酮、乙醇和甲醇等，其中乙醇本身無毒且易揮發，因此適用于藥物蛋白的純化。

2.3 熱沉淀方法

熱沉淀方法是利用不同蛋白的熱穩定性不同，從而通過加熱的方式除去熱穩定性差的蛋白，最后剩下熱穩定性高的蛋白，達到分離純化目的。該方法的優點是操作簡單、成本低；其缺點在于有較大的局限性，僅適用于純化耐熱蛋白。因此，使用該方法前，必須充分了解并確定目的蛋白的熱穩定性。徐春曉等[3]利用熱沉淀法純化了可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅱ，楊偉偉等[4]利用熱沉淀法純化了乙醛脫氫酶。

2.4 等電點沉淀法

等電點沉淀法是利用蛋白質在等電點時溶解度最低而各種蛋白質又具有不同等電點的特點進行分離的方法。在大多數的時候，并不能知曉雜蛋白的等電點，而且蛋白質在等電點時還存在一定的溶解度，使目的蛋白沉淀不完全。因此，等電點沉淀法不適合單獨使用，更適合作為輔助方法，結合其他純化方法來實現蛋白的沉淀分離。例如，將等電點沉淀法與鹽沉淀法相結合，便可取得較好的分離效果。

3 層析技術

3.1 分子篩凝膠層析

分子篩凝膠層析利用蛋白分子大小和形狀的不同進行分離。以惰性細顆?；|作為層析柱填料，由于液體的擠壓，大分子物質因無法進入細顆粒的微孔中而隨著液體從細顆粒間的縫隙流出，而小分子因進入細顆粒基質內微孔運動速度慢，保留時間長，比大分子物質流出緩慢而分離。此種層析方法條件溫和，填料分辨率高，操作簡便，但是上樣量較小，處理周期長，應用范圍受限[5]。

3.2 離子交換層析

離子交換層析利用蛋白分子在特定緩沖液環境下所帶電荷不同而與離子交換劑之間的相互作用不同，介質表面的可交換離子與帶相同電荷的蛋白分子發生交換[5-6]。該色譜柱填料的配基為離子交換劑，與蛋白組分通過靜電相互作用進行結合。在洗脫過程中緩沖液離子強度的改變將使結合力由弱到強的蛋白組分依次洗脫下來，達到分離純化的效果。在進行色譜柱選擇時要報據目的蛋白的PI值以及pH耐受能力選擇合適的離子交換柱。

3.3 疏水層析

疏水層析是利用蛋白分子的疏水性不同的性質開發的純化方法。疏水層析的填料由化學性質穩定、機械強度好的載體（如瓊脂糖、硅膠等）和疏水配基（如C6、C8等）組成。蛋白質表面存在著一些疏水區域，借助于疏水區域和疏水配基間的疏水相互作用力，蛋白質被吸附在色譜填料的表面，這種相互作用力包括疏水相互作用力、范德華力和靜電相互作用力。因為在高鹽濃度下疏水相互作用力為主導，隨著鹽濃度的降低，疏水相互作用力亦變小，所以具有“高鹽吸附、低鹽洗脫”的特點[5]。因此，利用不同蛋白質間的疏水性差異，通過改變洗脫時的鹽濃度就可以對蛋白質進行有效地分離純化。

3.4 反相層析

反相層析與疏水層析一樣，都是利用蛋白分子的疏水性差異來實現分離純化的技術。但是二者有區別，疏水層析的固定相是弱疏水配基，而反相層析的固定相含有高度非極性基團，且配基的密度要高很多，在疏水層析中用鹽濃度調節蛋白與固定相之間的相互作用，而反相層析通過有機溶劑調節，通過增加有機溶劑的濃度來實現蛋白的洗脫[2]。

3.5 親和層析

3.5.1 生物特異親和層析。生物特異親和層析以生物分子作為配體，可分為免疫親和層析、凝集素親和層析和核酸親和層析等，另外還有以酶、粘附蛋白、受體蛋白或底物為配體的親和層析。

3.5.2 人工配體親和層析。人工配體親和層析也稱為通用配體親和層析，是指利用一類人工配體對不同的蛋白質有親和性的特點，通過親和層析來純化這些蛋白質的方法。主要包括金屬螯合親和層析和染料配體親和層析等。

3.5.3 金屬螯合親和層析。金屬螯合親和層析也稱固相化金屬離子親和層析，是利用固定金屬離子螯合劑（如IDA和NTA）螯合二價金屬離子（如Ni2+、Zn2+、Cu2+和Co2+等），再與蛋白質表面暴露的一些氨基酸殘基（組氨酸、色氨酸、賴氨酸等）相互作用而進行的親和純化。金屬螯合親和層析具有配體簡單、通用性強、分離條件溫和、吸附量大等優點。Ueda等[7]應用Ni離子親和層析，并結合分子篩層析，分離得到大腸桿菌表達的人催乳素，其純度達到99.5%。

4 雙水相萃取技術

雙水相萃取技術是指把2種聚合物或1種聚合物與1種鹽的水溶液混合在一起，由于聚合物與聚合物之間或聚合物與鹽之間的不相溶性形成兩相，而不同蛋白質在這兩相中的溶解性不同，因而最終平衡時蛋白會按照一定比例分配在這兩相之中，當這個分配比例相差較大時，即目的蛋白大部分都溶解在某一液相中便可達到分離的目的。Kula等[8]最早將雙水相萃取分離技術應用于生物產品分離，由于其條件溫和、容易放大、可連續操作等特點，目前已成功應用于蛋白質分離和純化。龐博峰[9]在18%乙醇/22%K2HPO4雙水相體系中，pH=9.0條件下，使重組人胰島素分布在上相，回收率在98%以上。

5 純化技術組合法

目前，基因工程上游技術已經發展較為成熟，重組表達蛋白的來源也多種多樣，按照表達體系可分為大腸桿菌中的原核表達體系、酵母真核表達體系；昆蟲細胞真核表達體系及哺乳動物細胞真核表達體系，按照表達形式又可分為細胞外的分泌表達、細胞內可溶性表達、細胞內不溶性表達。由于不同類蛋白質的性質差異大、蛋白質本身的復雜性以及重組蛋白來源的多樣性，至今也沒有研發出一套適合所有重組蛋白分離純化的技術。一般蛋白的純化分離采取3步走的策略：第一階段是捕獲目標蛋白質，對目標蛋白進行分離、濃縮和穩定化處理，使樣品體積減小，方便操作；第二階段為中間提純階段，在該階段應除去大量雜質，如宿主蛋白、內毒素等；第三階段為最終提純階段，目的是獲得高純度的目標蛋白。

在實際工作中，需要根據具體情況設計純化策略。對于所有蛋白的純化分離過程中都需把握的原則是保證蛋白活性、回收率高、步驟盡量少、純度高。一般來說對于蛋白的純化都是采用不同分離純化技術的組合使得蛋白最后的活性、純度、回收率都較高。王曉軍等[10]依次利用硫酸銨沉淀、DEAE-52離子交換柱和Sephadex G-100過濾柱3次純化，重組蛋白的純度達到98%，回收率為80.5%；陳愛春[11]通過Q-Sepharose陰離子交換層析、Profinity eXact親和層析及Superdex75凝膠過濾層析的三步純化策略，從家蠶幼蟲血淋巴中純化獲得了較高純度的無標簽重組EGFP蛋白，純化倍數為860.5，蛋白回收率為26.7%；張虎成等[12]依次利用鎳柱親和層析、SephadexG-25凝膠過濾層析和DEAE-FF離子交換層析分離純化鏈球菌細胞壁蛋白。

6 展望

總的來說，目前對于基因工程表達的重組蛋白，還沒有一套通用的純化程序，只有針對某一種或一類蛋白結合不同的純化方法得到較純、活性較高的產品。隨著科技的進步，基因工程產品的分離純化必定會變得越來越簡單，成本也會越來越低，效率更高，操作更容易。

7 參考文獻

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