眼鏡蛇神經(jīng)毒素研究進展

蔣世強　潘能慶　鄢航

摘要 眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素（Cobrotoxin，CT）是一種短鏈神經(jīng)毒素，最早是從臺灣眼鏡蛇蛇毒中分離得到的。因其在鎮(zhèn)痛和抗癌方面有著顯著的效果而成為研究的熱點，本文通過對近年來CT的結構、藥理作用、鎮(zhèn)痛、抗癌研究進展進行綜述，旨在為各位研究者提供基礎參考資料。

關鍵詞 眼鏡蛇；神經(jīng)毒素；藥理作用；體外表達

中圖分類號 R282 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）04-0255-02

Abstract The cobra venom neurotoxin（Cobrotoxin，CT） is a kind of short chain neurotoxin that is isolated from the Taiwan cobra venom at the earliest.Because of its significant analgesic and anti-cancer effect，CT is becoming a hot research.This article summarized the research progress of structure，pharmacological effect，analgesic and anticancer of CT in recent years，aimed to provide basic references for researchers.

Key words cobrotoxin；pharmacological effect；in vitro expression

眼鏡蛇神經(jīng)毒素（Cobrotoxin，CT）不但在鎮(zhèn)痛作用上具有持久、無耐受性、無成隱性和不良反應少等優(yōu)點，同時具有抗癌作用。因此，其可開發(fā)成新型的鎮(zhèn)痛藥和抗癌藥，應用前景廣闊[1]。

1 眼鏡蛇神經(jīng)毒素的結構

1965年，Yang等通過CM-cellulose柱和Sephadex G-25柱從臺灣眼鏡蛇蛇毒中分離得到一種棒狀晶體蛋白，將其命名為神經(jīng)毒素，其毒性為粗毒的6.7倍，并具有熱穩(wěn)定性，但是通過胰蛋白酶消化后活性喪失[2]。CT的分子量約為7 KDa，由15種常見氨基酸組成，缺乏丙氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸，其空間結構為三指形，分子結構中一端為4個二硫鍵形成的致密內(nèi)核，由內(nèi)核向外伸出3對互為平行的肽鏈成三指形展開，分子中4個二硫鍵分別為Cys3-Cys24、Cys17-Cys41、Cys43-Cys54、Cys55-Cys60[3-6]。Yu等[7]研究發(fā)現(xiàn)CT的二硫鍵可以發(fā)生改變從而變成其同分異構體Cobrotoxin Ⅱ和Cobrotoxin Ⅲ，Cobrotoxin Ⅱ和Cobrotoxin Ⅲ二硫鍵分別變?yōu)镃ys43-Cys55、Cys54-Cys60和Cys43-Cys60、Cys54-Cys55（圖1）[8]。

2 眼鏡蛇神經(jīng)毒素的藥理作用

眼鏡蛇神經(jīng)毒素屬于短鏈突觸后神經(jīng)毒素，能以極強的親和力與突觸后膜上的煙酰胺型乙酰膽堿受體結合，阻止神經(jīng)-肌肉通路的去極化，阻礙神經(jīng)沖動傳導[9]。若過量的CT將神經(jīng)傳導完全阻礙時，生物個體將會死亡，Meng等[10]從孟加拉眼鏡蛇毒液中純化得到的CT對小鼠的LD50僅為0.08 mg/g。關于CT的作用機制及其作用的位點一直是研究的熱點，許多研究工作者已經(jīng)做了不少探究工作。Chang等[11]對CT分子中的酪氨酸殘基與其生物活性的關系進行了研究，發(fā)現(xiàn)Tyr-25殘基的完整性在保持CT的活性構象中起著至關重要的作用。Yang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，CT分子中精氨酸殘基的修飾與CT的致死性和抗原性相關，Arg-30和Arg-33與CT的致死性有關，而Arg-30和Arg-36則與CT的抗原性有著密切關系。此外，還有類似的研究發(fā)現(xiàn)，完整的Trp-29、His-32、Lys-47、Glu-21都對CT活性構象的保持起著重要作用[13]。目前，盡管找到了不少可以改變CT活性構象的因素，但是還是沒有確定CT的作用位點，因而其與乙酰膽堿如何結合的機制尚不清楚。Aoyagi等[14]通過人工合成與CT相似的肽鏈并進行相關試驗，能夠得到一些與CT相類似的反應，并且合成肽具有CT 20%的毒性活性。

3 眼鏡蛇神經(jīng)毒素的研究與應用

3.1 鎮(zhèn)痛研究及應用

眼鏡蛇神經(jīng)毒素的鎮(zhèn)痛研究歷史悠久，自從1965年CT從臺灣眼鏡蛇中分離純化之后，CT的鎮(zhèn)痛研究就開始了，因其在鎮(zhèn)痛方面具有高效性、無耐受性、無成隱性、不良反應少而被廣泛研究。Chen等[15]的研究揭示了CT作用的機制。CT主要是通過作用于乙酰膽堿受體，從而阻礙神經(jīng)傳導達到鎮(zhèn)痛的作用，對于CT鎮(zhèn)痛過程中發(fā)揮作用的位點至今還不確定，這也是今后的研究重點與難點，更是CT能否得到應用的關鍵點。

蛇毒鎮(zhèn)痛的應用早在我國20世紀70年代就出現(xiàn)了，曾才銘[16]用云南動物研究所用眼鏡蛇毒提純的神經(jīng)毒素制成的針劑克痛靈用于臨床治療慢性腰腿痛，共治療了100余例，取得一定的效果。同樣的，蒲道學[17]將克痛靈用于治療神經(jīng)性頭痛、三叉神經(jīng)痛、坐骨神經(jīng)痛共96例病人并且都取得了一定療效。這個名為“克痛靈”的蛇毒制劑的主要成分便為蛇毒神經(jīng)毒素，CT便是其鎮(zhèn)痛的主要成分之一。盡管我國蛇毒制劑的應用當時得到一定程度的推廣，但是這個名為“克痛靈”的蛇毒制劑并沒有得到更好的發(fā)展和升級，最后被市場淘汰，導致其淘汰的主要原因有4個：其一，當時蛋白分離技術的限制，導致得到的蛇毒制劑中含有其他成分，從而導致蛇毒制劑的效果不一致，有時還會有較大的副作用；其二，對蛇毒制劑的檢測及監(jiān)管不到位，導致蛇毒假制劑四處橫行，最終導致這個行業(yè)的沒落；其三，蛇毒分離成本過高，分離過程中回收率低，損失較多，因而無法產(chǎn)生更廉價的商品；其四，蛇毒的作用機制研究進展緩慢限制了蛇毒的應用。

3.2 抗癌研究

目前，CT在抗癌方面的研究報道還不像其鎮(zhèn)痛報道那樣多，不過在抗癌方面的研究并沒有停止過，最近Shen等[18-19]報道了CT的抗癌作用，其研究結果顯示，CT能夠明顯抑制A549細胞的體外生長，并且在CT作用過程中，通過激活P38-MARK信號通路上調(diào)細胞自噬的作用。此外，CT還能抑制A549細胞在裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移。盡管CT的抗癌研究還不夠深入，但是從目前的研究報道來看，CT在抗癌的開發(fā)方面具有一定的潛力。人們期待在CT的抗癌效果、范圍、機制方面進行更深入的研究，以便為CT的抗癌應用打下堅實的基礎。

4 眼鏡蛇神經(jīng)毒素體外表達的研究

眼鏡蛇神經(jīng)毒素的克隆和表達始于20世紀90年代，主要得益于分子生物學的快速發(fā)展，越來越多的基因被克隆，以及克隆的效率越來越高。對于CT的克隆與表達的研究目的主要有2個，一是為了方便對CT本身的研究，例如對其序列進行分析，或是對CT序列進行定點突變，再進行表達，從而確定某個點對CT的活性、結構的影響，Chang等[20]對特定的氨基酸進行改變，研究了單個氨基酸替換對整個分子結構的影響；二是為了獲得CT蛋白，以便應用于實踐中。由于蛇毒資源有限、蛇毒分離成本高、蛇毒成分復雜藥理作用不同，因而通過基因工程技術產(chǎn)生成分單一的蛇毒是破解這幾個難題的重要途徑，鄢航等[21-22]利用原核表達系統(tǒng)和真核系統(tǒng)對CT進行了表達，獲得了該蛋白，并檢測了其活性，結果發(fā)現(xiàn)，原核表達的CT活性不理想，而真核表達的CT具有較好的鎮(zhèn)痛活性，然而其采用的是昆蟲細胞表達，盡管表達蛋白的活性及產(chǎn)量都還不錯，但是該方法的成本較高，并不適合規(guī)?；a(chǎn)[23-27]。

5 展望

眼鏡蛇神經(jīng)毒素作為突觸后神經(jīng)毒素，有著非常好的鎮(zhèn)痛效果及無成隱的優(yōu)點，已經(jīng)被研究了幾十年，也取得了不錯的成果，但是就目前情況來看，其鎮(zhèn)痛的機制及體外表達還有待進一步研究。人們期待早日在這2個方面取得突破性的成果，為CT的廣泛應用鋪平道路。

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