白細胞介素10通過抑制自噬調節(jié)樹突狀細胞功能①

屈玉蘭 鄧捷文 鄧常文 夏福燦 郭振紅 白 沖

(第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科,上海200433)

白細胞介素10通過抑制自噬調節(jié)樹突狀細胞功能①

屈玉蘭 鄧捷文②③鄧常文 夏福燦④郭振紅③白 沖

(第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科,上海200433)

目的：研究白細胞介素10(Interleukin-10,IL-10)對樹突狀細胞(Dendritic cells,DCs)自噬及功能的影響。 方法：體外培養(yǎng)C57BL/6小鼠骨髓來源的DCs分為對照組、LPS刺激組、IL-10干預組、IL-10與雷帕霉素干預組、雷帕霉素干預組，分別通過流式細胞術分析DCs表面共刺激分子CD40、CD80的表達、DCs攝取OVA抗原的比例以及誘導OT2細胞增殖比例，ELISA檢測DCs分泌IL-6，TNF-α的水平等DCs相關功能；蛋白免疫印跡法檢測DCs自噬蛋白LC3的表達，比較組間差異，以探討IL-10對DCs功能及自噬的影響。 結果：(1)與LPS刺激組比較，IL-10處理組DCs的表面共刺激分子CD40、CD80的表達下降、分泌IL-6、TNF-α水平下降、刺激T細胞增殖的比例明顯減弱、攝取OVA抗原的能力增加，IL-10+雷帕霉素干預組的DCs與IL-10單獨處理組相比，表面CD80的表達明顯增加(P<0.05)、分泌IL-6、TNF-α能力及刺激T細胞增殖的能力均明顯增加(P<0.000 1)。(2)DCs的自噬相關蛋白(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例)明顯下降。 結論：IL-10可能通過抑制DCs自噬水平調節(jié)樹突狀細胞功能。

白細胞介素10；樹突狀細胞；自噬；調節(jié)功能

樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)作為目前最強大的抗原遞呈細胞，在腫瘤、炎癥及其他免疫反應中起著關鍵作用，與多種疾病(如：腫瘤、哮喘、自身免疫性腦脊髓炎等)密切相關[1]。DCs逐漸成熟的過程中，其表面共刺激分子及MHCⅡ表達增加，成為T淋巴細胞依賴的免疫反應最有效的誘導者。因此調控DCs的功能對抑制疾病的發(fā)生發(fā)展具有至關重要的作用。IL-10是Th2型細胞因子的家族成員，目前被認為最重要的負調控因子之一，具有強大的抗炎和免疫抑制作用。包括樹突狀細胞在內，其他如T細胞、巨噬細胞、B細胞在參與免疫反應時都能產(chǎn)生IL-10[2]。IL-10-/-小鼠生存能力及感染嚴重程度也明顯低于野生組。既往研究表明IL-10能夠影響DCs的分化及其表面共刺激分子的表達。如IL-10能夠抑制IFN-γ和 TNF-α 對DCs表面共刺激分子的活化[3,4]。但是IL-10到底如何調節(jié)DCs的功能仍然存在爭議。

自噬是廣泛存在于真核生物的基本生命現(xiàn)象復制，在大多數(shù)細胞內起著“清道夫”的作用，是細胞內細胞器和其他結構自然減員和更新的正常途徑[5]。自噬分為大自噬、小自噬和分子伴侶介導的自噬，而大自噬是最主要的方式[6]。自噬作為一種進化保守的細胞降解途徑，涉及廣泛，在包括腫瘤、衰老、炎癥在內的各種免疫反應中都起重要作用[5,7]，研究發(fā)現(xiàn)自噬不僅在DCs的發(fā)育過程中起著重要的作用，即外周血單核細胞在向DCs轉化的過程中，自噬明顯增強[8]，而且自噬與DCs的功能也存在一定的關系，如RSV病毒感染后，能誘導DCs發(fā)生自噬從而分泌炎性因子，發(fā)生天然免疫反應[9]。TLR信號通路的激活能明顯促進DCs的成熟及炎癥因子的分泌，LPS作為經(jīng)典的TLR4刺激劑也能通過促進DCs自噬從而活化DCs[10,11]。因此通過抑制DCs自噬可能成為抑制DCs活化的途徑。我們研究發(fā)現(xiàn)IL-10能抑制LPS對DCs的活化作用，并且這一作用可能通過抑制DCs自噬實現(xiàn)的。這一研究有望為臨床治療DCs相關疾病提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑 C57BL/6小鼠，雄性，6～8周齡，均購自上海必凱實驗動物有限公司[許可證號：SYXK(滬)2013-0058]。C57/B6及OT2小鼠均在第二軍醫(yī)大學免疫學國家重點實驗室SPF級動物房飼養(yǎng)[許可證號：SYXK(滬)2013-0016]。所有動物實驗經(jīng)第二軍醫(yī)大學實驗動物倫理委員會批準。Chicken Ovabu min(OVA)購自美國Sigma公司。不同熒光標記的大鼠抗小鼠流式抗體 CD11c-PE、CD11c-APC、CD86-PE、CD80-FITC、CD40-PE、IaKb-FITC、CD4-APC,以及FITC、APC或者PE標記的同行對照IgG2 等均購自美國BD Pharmingen公司，分裝后于4℃保存；rmIL-10購自美國PeproTech公司。小鼠重組GM-CSF、IL-4購自Promega公司，分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩L-6、TNF-α ELISA試劑盒均購自e-Bioscience公司。細胞裂解液(Cell lysis buffer)、蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor cocktail set Ⅲ,EDTA-Free)LC3B抗體等均購自美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓樹突狀細胞的培養(yǎng) 頸椎脫臼法處死C57BL/6小鼠，無菌取出股骨脛骨，1 ml注射器沖洗出骨髓細胞，用移液槍吹成單細胞懸液后離心，Tris-NH4Cl溶解紅細胞，過濾后離心，用完全培養(yǎng)基(RPMI1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清+mGM-CSF 10 ng/ml+mIL-4 1 ng/ml),重懸后加入6孔板培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后，棄除培養(yǎng)基及懸浮細胞，重新加入新鮮完全培養(yǎng)基，以后每天換液。第5天的為未成熟骨髓來源的樹突狀細胞(immuture bone marrow-derived dendritic cell,im-BMDC)，第7天以后的為成熟的樹突狀細胞(m-BMDC)。

1.2.2 BMDCs表面共刺激分子及分泌細胞因子的檢測 觀察IL-10對培養(yǎng)BMDC作用時，將常規(guī)培養(yǎng)的BMDC于第5天吹下疏松貼壁的增值性細胞聚集體，即為富集的BMDC。離心后用含10%FBS的血清重懸細胞并鋪于24孔板(1×106細胞/孔)，將實驗分為：(1)空白對照組；(2)LPS 100 ng/ml刺激組；(3)IL-10干預組 ；(4)IL-10+雷帕霉素干預組；(5)雷帕霉素干預組。37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)12 h后，分別收集各孔的細胞及培養(yǎng)上清。ELISA法檢測各組細胞培養(yǎng)上清中的IL-6、TNF-α的水平，流式細胞術分析DCs表面共刺激分子的表達水平。

1.2.3 流式檢測BMDCs攝取OVA抗原的能力 觀察IL-10對BMDCs對OVA抗原的攝取能力時，將實驗分為空白對照，LPS(100 ng/ml)刺激組，IL-10預處理后LPS刺激組。即預先用IL-10處理BMDCs 10 h后，用LPS刺激12 h,將細胞收集后轉入1.5 ml EP管中，各組分為4℃冰箱中孵育組和37℃孵箱中孵育組。處理Blank組，不加入OVA外，余各組加入熒光標記的OVA(1∶2 000)孵育2 h后，冷的PBS洗滌2次后，加入CD11c-PE流式抗體，4℃孵育30 min后用冷的PBS洗滌后重懸，進行流式檢測。

1.2.4 T淋巴細胞增殖實驗及T細胞活化反應檢測 頸椎脫臼發(fā)處死OT2小鼠，無菌取出脾臟，研磨制備單細胞懸液，用Tris-NH4Cl破紅后，濾網(wǎng)過濾后離心，棄上清，CD4磁珠分選出T細胞并細胞計數(shù)。CFSE進行細胞染色，用預冷的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌1次。 OT2細胞計數(shù)后用10%1640培養(yǎng)基調整細胞濃度為106個/ml，并以105個/孔鋪板于96孔圓底培養(yǎng)板，各組DCs加入到預置孔中，以DCs∶T=1∶10比例鋪板。37℃、5%CO2的孵箱中孵育72 h后檢測T細胞增殖情況。

1.2.5 Western blot檢測各組BMDC自噬水平 收集第5天的BMDC，以3×106鋪板于6孔板。①用LPS刺激DCs，收集不同時間點的DCs。①找出LPS刺激DCs發(fā)生自噬的最強時間點；②用IL-10預處理DCs后，加入LPS(100 ng/ml)刺激,在上述得出的最佳時間點收集細胞，用冷PBS洗滌后，加入細胞裂解液冰上裂解半小時，4℃離心機12 000 r/min離心10 min后吸取上清。BCA法測定蛋白濃度并將濃度配平后，加入準備好的上樣緩沖液，于100℃水浴鍋煮沸5 min，各取30 μg蛋白進行12%SDS-PAGE電泳，60 V電泳30 min后以120 V電泳60 min，再以100 V、90 min恒壓轉移到NC膜上。再用5%脫脂奶粉/TBST室溫下封閉1.5 h，分別用羊源的α-actin抗體(1∶500),兔來源的P62抗體(1∶3 000)，LC3 Ⅱ(1∶1 000)，4℃孵育過夜。次日用相對應的二抗在室溫孵育1 h后，加入AB液曝光。

2 結果

2.1 IL-10能抑制DCs功能且能被自噬促進劑雷帕霉素逆轉

2.1.1 IL-10能抑制DCs表面活化標記 在細胞培養(yǎng)第5天時，將IL-10預處理DCs后，再用LPS刺激后發(fā)現(xiàn)，LPS能明顯刺激DCs活化，而用IL-10處理后則能明顯抑制DCs表面共刺激分子CD80，CD40的表達(圖1A、B)，并且差異均具有統(tǒng)計學意義(各組間比較，F(xiàn)A=21.28，F(xiàn)B=48.29;PA,B<0.000 1)。且IL-10對DCs的抑制能夠被雷帕霉素部分逆轉(圖1A、B)。結果顯示IL-10可以抑制LPS對DCs的活化。

2.1.2 IL-10抑制DCs分泌細胞因子 ELISA檢測細胞因子也發(fā)現(xiàn)，LPS刺激組DCs分泌IL-6、TNF-α水平明顯增高。而IL-10處理后的DCs分泌這兩種細胞因子的能力均明顯下降(圖2)，并且具有統(tǒng)計學意義(各組間比較，F(xiàn)A=46.25，F(xiàn)B=904.9;PA，B<0.000 1)。重新加入自噬刺激劑雷帕霉素后卻能部分逆轉DCs分泌這兩種細胞因子的功能(如圖2所示，DCs+LPS+IL-10組與DCs+LPS+IL-10+repa組相比差異都具有統(tǒng)計學意義)。

2.1.3 IL-10增加DCs攝取OVA抗原 未成熟DCs具有更好的攝取抗原能力，而隨著DCs的不斷成熟，DCs抗原攝取能力不斷下降而抗原處理和遞呈能力不斷增加，從而刺激T細胞增殖。結合之前的結果顯示，LPS雖然能明顯活化DCs，其攝取OVA抗原的能力卻是明顯下降的，但是 IL-10處理DCs后，DCs攝取OVA的能力又開始增加(圖3A),并且具有統(tǒng)計學意義(各組間比較，F(xiàn)=19.48，P=0.002 4,圖3B)，這也表明IL-10能夠抑制DCs的活化及成熟。

2.1.4 IL-10抑制T細胞增殖及T細胞活化 將不同組的DCs與DO11.10小鼠來源的脾臟T細胞，即OVA323～339特異性的CD4+細胞(OT2細胞)，共培養(yǎng)72 h后,流式檢測CFSE+CD4+T cell增殖情況發(fā)現(xiàn)：加入DCs后，CFSE染色的OT2細胞增殖明顯增強，LPS則能進一步促進DCs刺激T細胞的增殖，而IL-10處理后的DCs組，CFSE增殖的比例則明顯減少，但IL-10對DCs的這一抑制過程可以被自噬刺激劑雷帕霉素部分逆轉(圖4A)。并且差異具有統(tǒng)計學意義(圖4B,各組間比較，F(xiàn)=112.7,P<0.000 1)。

2.2 IL-10能抑制DCs自噬 目前認為細胞發(fā)生自噬時，LC3蛋白合成后，其羧基端會被Atg4所剪切，產(chǎn)生細胞漿定位的LC3-Ⅰ,LC3-Ⅰ會被包括Atg7和Atg3在內的泛素樣體系所修飾和加工，產(chǎn)生LC3-II并定位到自噬小體中。這樣LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ含量與發(fā)生自噬的程度成正比，并且作為細胞自噬的標記[12]。在體外用LPS刺激DCs誘導自噬，觀察不同時間點樹突狀細胞的自噬情況。發(fā)現(xiàn)LPS刺激12 h后DCs發(fā)生自噬最強(圖5A)。而用IL-10處理DCs發(fā)現(xiàn)，相比于陽性對照組，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明顯下降，即提示DCs自噬減弱(圖5B),用Image Pro-Plus6軟件測量灰度值后統(tǒng)計分析顯示IL-10能明顯降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，統(tǒng)計具有統(tǒng)計學意義(圖5C,各組間比較，F(xiàn)=57.77，P=0.000 1)。

圖1 IL-10抑制LPS誘導DCs的活化Fig.1 IL-10 inhibits DC activation induced by LPSNote: **.P<0.01;**.P<0.001；***.P<0.000 1.

圖2 IL-10抑制DCs分泌細胞因子Fig.2 IL-10 inhibits ability of DCs to secret cytokinesNote: **.P<0.01;**.P<0.001；***.P<0.000 1.

圖3 IL-10影響DCs攝取OVA抗原Fig.3 IL-10 influences process of DCs taking in OVA antigenNote: A.OVA antigen taken by DCs in different situation as deter-mined by FACS;B.Data are representative of two or three independent experiments.Data were analyzed with analysis of variance (ANOVA).*.P<0.005;**.P<0.001.

圖4 IL-10抑制DCs刺激T細胞增殖的能力Fig.4 IL-10 suppresses ability of DCs to stimulate T cells proliferationNote: A.Inhibition of naive CD4+ OVA-specific transgenic DO11.10 T cells cultured with DCs in different situation pulsed with pOVA323-339(DC∶CD4+T =1∶10).Negative CFSE percentage indicate the proliferation of CD4+T cells.One of three independent experiments are shown；B.Histograms show CFSE gated CD4+T proliferation by DCs in different situation.Data shown are representative of three independent experiments.Data were analyzed with analysis of variance(ANOVA).*.P<0.05;***.P<0.000 1.

圖5 IL-10抑制LPS誘導DCs的自噬Fig.5 IL-10 disrupts autophagy reaction of DCs induced by LPSNote: A.Western blot of autophagy related protein LC3 from ctr-DC stimulated in different time and not stimulated with LPS;B.Western blot of autophagy related protein LC3 from ctr-DC and IL-10 conditioned DC,stimulated and not stimulated with LPS at 12 h are shown.Anti-β-actin was used as control.One of three independent experiments are shown;C.Histograms show the ratio of LC3Ⅱ/LC3Ⅰin ctr-DC and in MSC-conditioned DC after 12 h of LPS stimulation.Data shown are representative of three independent experiments.Data were analyzed with analysis of variance(ANOVA).**.P<0.001.

3 討論

自噬作為一種通過自我消化錯誤折疊蛋白或者細胞碎片獲取“營養(yǎng)”，實現(xiàn)細胞自我更新及發(fā)揮功能的重要途徑，是大自然普遍存在的生命現(xiàn)象，自噬不僅參與體內穩(wěn)態(tài)及細胞功能的維持，自噬的紊亂也與多種疾病密切相關。既往研究表明，包括阿爾茨海默病、帕金森氏病在內的多種神經(jīng)退行性病變的患者中都存在自噬體的聚集，而在肝臟疾病、衰老等患者的相應部位也能發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象[13]。自噬與感染、免疫反應，以及炎癥性疾病更是密不可分的。有研究認為，自噬在活化的天然免疫和適應性免疫反應中都具有重要作用。在適應性免疫反應中，DCs等抗原提呈細胞在處理內源性或者外源抗原至MHC分子時都需要自噬的參與。那么，在某些可能由于自噬水平增加引起免疫反應增強的疾病中，抑制自噬的水平顯得尤為重要。IL-10作為目前認為最強的免疫抑制性的細胞因子，在多種細胞或者藥物緩解疾病的過程中表達也明顯增高[14]。那么IL-10是否通過抑制自噬水平從而抑制免疫反應？本研究以最重要的抗原提呈細胞DCs為干預對象，展開研究。結果發(fā)現(xiàn)IL-10預處理DCs后， LPS活化DCs的能力明顯下降：DCs表面共刺激分子的表達，炎癥因子的分泌，刺激T細胞增殖能力均明顯下降。這與既往研究是保持一致的[2]。然而IL-10對DCs的功能抑制，在加入自噬刺激劑雷帕霉素之后，DCs表面共刺激分子CD80、CD40的表達水平，刺激T細胞增殖以及分泌細胞因子的能力都出現(xiàn)了完全或者部分逆轉。這表明IL-10可能通過抑制細胞自噬實現(xiàn)對DCs功能的抑制。Western blot進一步對自噬相關蛋白LC3進行檢測發(fā)現(xiàn)，IL-10處理組能明顯降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值,表明IL-10能抑制DCs自噬。初步得出結論：即IL-10可能通過抑制DCs自噬下調DCs的功能。既往研究已經(jīng)提示自噬在DCs的發(fā)育過程中起著重要的作用，外周血單核細胞在向DCs分化的過程中自噬不斷增強。而IL-10處理后,這個過程可被抑制，使得DCs停留在其前體單核細胞的階段[8]。但是該研究對DCs的功能未做討論，以及外界環(huán)境對DCs的影響引起的DCs的自噬是否能被IL-10抑制以及與DCs功能的關系也未做探討。也有研究發(fā)現(xiàn)DCs能夠選擇性地利用自噬機制，如ATG5，攝取及處理胞外抗原，通過MHCⅡ分子遞呈給CD4+T細胞，從而發(fā)生免疫反應[15]。本研究則在體外模擬炎癥環(huán)境，通過LPS刺激未成熟的DCs促進其成熟活化，并探討其與DCs自噬的關系發(fā)現(xiàn)，LPS刺激DCs功能增強至最大的時間點DCs自噬的時間點基本是吻合的。 并發(fā)現(xiàn)IL-10預處理DCs后，LPS對DCs的活化作用明顯降低，而這也是伴隨著DCs自噬的下降的。當再次加入自噬刺激劑雷帕霉素時，這種抑制作用出現(xiàn)了部分逆轉。這些證據(jù)均提示：IL-10可能通過抑制DCs自噬下調DCs的功能的,為IL-10如何調控DCs的功能做了進一步的機制研究。但是自噬是一個復雜的過程，對于IL-10到底通過什么抑制DCs自噬，是某一明星分子扮演了重要角色還是IL-10抑制了自噬過程中某一環(huán)節(jié)，仍然值得進一步探討。但是值得肯定的是DCs自噬和其功能存在一定關系，一定范圍內，自噬越強，DCs功能越強。自噬是把雙刃劍，適當?shù)淖允赡軌虼龠M細胞的生存及代謝，過度自噬則會引起細胞凋亡增加，從而降低細胞功能[16,17]。因此，如何合理調節(jié)自噬，游刃有余地控制自噬，從而調節(jié)細胞的功能顯得尤為重要。深入研究IL-10如何影響DCs功能有助于更好地研究這一科學問題。

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[收稿2016-08-13 修回2016-10-25]

(編輯 張曉舟)

Interleukin-10 regulates functions of dendritic cell through autophagy inhibition

QUYu-Lan,DENGJie-Wen，DENGChang-Wen,XIAFu-Can,GUOZhen-Hong,BAIChong.

DepartmentofRespiratoryCriticalCareMedicine，ChanghaiHospital，SecondMilitaryMedicalUniversity，Shanghai200433，China

Objective:To study the mechanism of interleukin-10(IL-10)inhibiting the function of dendritic cells(DCs).Methods: Cultured C57BL/6 mouse bone marrow-derived DCs were divided into 5 groups:control group,LPS stimulated group,IL-10 treated group,IL-10+Rapamycin treated group and Rapamycin treated group.The regulatory mechanism of IL-10 on dendritic cells were evaluated from DCs function,Flow cytometry was used to analyse the expression of DCs surface co-stimulator CD80,CD40 expression,the ability of uptaking antigen and stimulating T cell to proliferate;ELISA was used to detect the cytokines IL-6 and TNF-α .Western blot was used to analyse the autophagy related protein LC3.Compared the differences between the groups.Results: (1)Compared to LPS stimulated group,IL-10 treated group，DCs surface co-stimulator CD40,CD80 were decreased,IL-6 and TNF-α secretion level and the ability to stimulate T cell to proliferate were decreased,the ability to capture OVA antigen was increased.Compared to IL-10 treated group,the DCs surface co-stimulator CD80 was decreased(P<0.05),IL-6 and TNF-α secretion level and the ability to stimulate T cell to proliferate were increased(P<0.000 1)in IL-10+rapamycin treated group.In addition,autophagy related proteins LC3Ⅱ/LC3Ⅰ was decreased in IL-10 treated group.Conclusion: IL-10 may regulate functions of DCs through inhibiting the autophagy of DCs.

Interleukin-10;Dendritic cells;Autophagy;Functions regulation

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.003

①本文受國家自然科學基金面上項目(81270073，81570019)資助。

屈玉蘭(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事慢性氣道疾病與樹突狀細胞相關性的機制研究。

及指導教師：白 沖(1964年-)，男，博士，教授，主要從事慢性呼吸道疾病的相關研究，E-mail：bc7878@sohu.com。

R392.12

A

1000-484X(2017)03-0333-05

②共同第一作者。

③第二軍醫(yī)大學醫(yī)學免疫學國家重點實驗室，上海200433。

④浙江大學醫(yī)學院免疫研究所，杭州310058。