水飛薊賓葡甲胺鹽對肝纖維化大鼠的療效和可能機制①

陳應康 佘福強 劉大騰 朱建超 劉 燕 田培燕

(黔南民族醫學高等專科學校，南州558000)

水飛薊賓葡甲胺鹽對肝纖維化大鼠的療效和可能機制①

陳應康 佘福強 劉大騰 朱建超 劉 燕 田培燕

(黔南民族醫學高等專科學校，南州558000)

目的：考察水飛薊賓葡甲胺鹽對肝纖維化大鼠的療效和可能機制。方法：將肝纖維化大鼠相隨機分為4個組別，即模型組、水飛薊賓葡甲胺鹽高劑量組120 mg/kg、水飛薊賓葡甲胺鹽中劑量組60 mg/kg和水飛薊賓葡甲胺鹽低劑量組30 mg/kg，將同期正常大鼠作為正常對照組，每組10只，連續給藥4周。結果：試驗全程無死亡大鼠。與正常組比，模型組大鼠體重減少，少動，毛發暗淡，肝臟指數減少(P<0.05)，脾臟指數增加(P<0.05)，與模型組相比，水飛薊賓葡甲胺各組體重明顯增加(P<0.05)，活動較好，毛發色澤有改善，肝臟指數明顯增加(P<0.05)，脾臟指數明顯降低(P<0.05)。與對照組比，模型組的ALT、AST和TBIL增高(P<0.05)，ALB降低(P<0.05)，與模型組相比，水飛薊賓葡甲胺各組的ALT、AST和TBIL顯著降低(P<0.05)，ALB顯著增高(P<0.05)。與對照組比，模型組的TG、TC和LDLC增高(P<0.05)，與模型組相比，水飛薊賓葡甲胺各組的TG、TC和LDLC顯著降低(P<0.05)。與對照組相比，模型組的LXRα及SREBP1c蛋白顯著增高(P>0.05)，與模型組相比，水飛薊賓葡甲胺各組的LXRα及SREBP1c蛋白顯著降低(P<0.05)。模型組大鼠的肝小葉消失，中度增生的顯微組織將肝小葉分為不同的假小葉，大部分肝細胞明顯脂肪變性，點灶狀壞死，水飛薊賓葡甲胺各組的肝組織，肝小葉恢復，肝細胞脂肪變性改善，壞死點灶明顯減少。結論：水飛薊賓葡甲胺鹽具有治療肝纖維化的作用，在改善肝功能和降低血脂方面具有顯著優勢，與降低肝組織的LXRα和SREBP1c表達有關，但降低上述兩種蛋白的機理仍有待進一步考察。

水飛薊賓葡甲胺鹽；肝纖維化；肝功能；血脂；肝組織蛋白

水飛薊素(Silybum marianum)是世界級公認的保肝藥物，在急慢性肝炎、肝硬化和中毒性肝損傷中均有應用，具有保護肝細胞膜和改善肝功能的作用。水飛薊素在結構上屬黃酮類天然混合物，是經菊科植物水飛薊(Silibum marianum gaertn)果實提取得到，水飛薊賓是水飛薊素發揮藥效的主要成分，但水飛薊賓不溶于水，且脂溶性不高，因此口服吸收差，在其結構的羥基位置引入極性基團，可提高水溶性[1-3]，水飛薊賓葡甲胺鹽(Silibinin-N-methylglucamine)就是個水飛薊賓衍生物的成功案例，水飛薊賓葡甲胺鹽因其良好的水溶性，已被制成片劑和膠囊，臨床廣泛使用。肝纖維化(Hepatic fibrosis,HF)是多種慢性肝病的病理學發展到肝硬化的關鍵過度階段，其預后備受關注，也是近年來肝病研究的重點[4-6]。水飛薊賓葡甲胺鹽在治療肝硬化方面具有確切的效果，但近些年對其可能機制研究較少，少有的研究涉及指標也并不系統，肝臟肝X受體α(Liver X receptor-α，LXRα)和醇調節元件結合蛋白1c(Steml regulatory element-binding protein-1c，SREBP1c)是肝纖維化的重要指標。本課題擬采用纖維化大鼠為受試對象，考察水飛薊賓葡甲胺鹽對纖維化大鼠在肝功能、血脂和肝組織LXRα和SREBP1c蛋白表達的影響，為臨床應用水飛薊賓葡甲胺鹽提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試動物 清潔級(SPF級)SD大鼠，全雄性，體重180～220 g，購自重慶市中藥研究院實驗動物研究所，合格證號：SCXK(渝)。12 h白天日光燈照射，自由飲食飲水。

1.1.2 受試試劑和藥物 二甲基亞硝胺(DMN)市試劑廠。丙氨酸氨基轉移酶(Alanine aminotransaminase,ALT)、白蛋白(Albumin,ALB)、總膽紅素(Total bilirubin,TBIL)、血清甘油三酯(Triglyceride,TG)和膽固醇(Total cholesterol,TC) 試劑盒購自南京建成生物工程研究所。水飛薊賓葡甲胺鹽，國藥準字H32026145，批號：20150101，規格：50 mg/片，江蘇中興藥業有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 肝纖維化大鼠制備 采用二甲基亞硝胺以10 μg/kg的劑量腹腔注射，1次/d，連續4周。

1.2.2 分組與給藥 將肝纖維化大鼠隨機分為4個組別，即模型組，水飛薊賓葡甲胺鹽高劑量組120 mg/kg、水飛薊賓葡甲胺鹽中劑量組60 mg/kg和水飛薊賓葡甲胺鹽低劑量組30 mg/kg，將同期正常大鼠作為正常對照組，每組10只，連續給藥4周。

1.2.3 指標檢測

1.2.3.1 肝功能檢測 試驗結束后，處死大鼠，取腹主動脈血，離心取血清，采用全自動生化儀，按試劑盒的要求檢測血清中的ALT、ALB和TBIL水平。

1.2.3.2 血脂水平檢測 取血清，采用全自動生化儀，按試劑盒的要求檢測血清中的TC、TG和LDLC水平。

1.2.4 肝臟LXRα和SREBP1c表達檢測及肝病理

1.2.4.1 LXRα和SREBP1c表達肝總蛋白提取 處死大鼠，取肝臟，稱重，按照 1∶10加 RIPA 裂解液，冰浴超聲碾碎呈勻漿狀，10 000 r/min離心10 min，收上清。BCA 法測定總蛋白，根據蛋白標準曲線，定量所提取肝蛋白。

1.2.4.2 BCA法測定總蛋白 Western blot分析小鼠肝臟組織蛋白表達：根據文獻提示[7]，將肝總蛋白20 μg 加 5×上樣緩沖液，100℃沸水變性，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，進行凝膠電泳，撥膠，轉膜，將轉膜后的 PVDF膜放入雜交袋，加入 TBST 稀釋的一抗LXRα(1∶1 000)、SREBP1c (1∶1 000) 和β-actin (1∶5 000)，封口，室溫孵育 1 h，4℃孵育過夜。TBST洗一抗3 次，將 PVDF膜放入雜交袋，加二抗，室溫孵育 1 h，TBST洗二抗3 次，顯影。蛋白條帶利用 β-actin 標準化，采用美國 Kodak Image Station 4000R 凝膠成像系統顯影分析。

1.2.5 肝組織HE染色 試驗結束后，處死大鼠，分離肝，中性甲醛緩沖液固定、包埋、切片、脫水、透明和HE染色。

2 結果

2.1 水飛薊賓葡甲胺鹽對肝纖維化大鼠生存狀態的影響 試驗全程無死亡大鼠。與正常組比，模型組大鼠體重減少，少動，毛發暗淡，肝臟指數減少(P<0.05)，脾臟指數增加(P<0.05)，與模型組比，水飛薊賓葡甲胺各組體重明顯增加(P<0.05)，活動較好，毛發色澤有改善，肝臟指數明顯增加(P<0.05)，脾臟指數明顯降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性關系，見表1、2。

表1 水飛薊賓葡甲胺鹽對肝纖維化大鼠體重的影響

Tab.1 Effect of Silybinin meglumine on body weight of hepatic fibrosis rats

Groups0w1w2w3w4wControlgroup191.2±8.7216.8±8.7226.8±6.9234.1±11.0245.6±12.4Modelgroup189.5±8.9173.5±6.91)152.4±7.21) 143.7±10.81) 136.7±13.51)Silibininmegluminelowdosegroup193.8±11.4181.5±7.82)175.4±6.62) 162.3±8.922)150.5±9.42)Silibininmegluminemiddledosegroup195.1±10.5185.4±8.62)181.7±7.42) 175.8±10.42)3) 168.7±13.92)3)Silibininmegluminehighdosegroup186.8±9.4184.9±7.82) 189.5±7.22)3) 192.7±11.12)3)4) 195.9±10.82)3)4)F1.143.0146.9107.7126.5P0.3457.94E-153.3E-251.94E-227.25E-24

Note：Compared with control group,1)P<0.05；compared with model group,2)P<0.05；compared with low dose Silybinin meglumine,3)P<0.05；compared with middle dose Silybinin meglumine,4)P<0.05.

2.2 水飛薊賓葡甲胺鹽對肝纖維化大鼠肝功能的影響 與對照組相比，模型組的ALT、AST和TBIL增高(P<0.05)，ALB降低(P<0.05)，與模型組相比，水飛薊賓葡甲胺各組的ALT、AST和TBIL顯著降低(P<0.05)，ALB顯著增高(P<0.05)，且呈劑量依賴性關系(P<0.05)，見表3。

表2 水飛薊賓葡甲胺鹽對肝纖維化大鼠肝脾系數的影響

Tab.2 Effect of Silybinin meglumine on liver and spleen indexes of hepatic fibrosis rats

GroupsLiverindex(%)Spleenindex(%)Controlgroup2.64±0.220.19±0.05Modelgroup1.51±0.341)0.52±0.101)Silibininmegluminelowdosegroup1.73±0.272)0.41±0.102)Silibininmegluminemiddledosegroup1.86±0.182)3)0.32±0.082)3)Silibininmegluminehighdosegroup2.39±0.242)3)4)0.23±0.092)3)4)F30.4624.36P2.74E-123.99E-11

Note：Compared with control group,1)P<0.05；compared with model group,2)P<0.05；compared with low dose Silybinin meglumine,3)P<0.05；compared with middle dose Silybinin meglumine,4)P<0.05.

2.3 水飛薊賓葡甲胺鹽對肝纖維化大鼠血脂的影響 與對照組相比，模型組的TG、TC和LDLC增高(P<0.05)，與模型組相比，水飛薊賓葡甲胺各組的TG、TC和LDLC顯著降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性關系(P<0.05)，見表4。

2.4 水飛薊賓葡甲胺鹽對肝纖維化大鼠肝組織的LXRα及SREBP1c蛋白表達的影響 與對照組相比，模型組的LXRα及SREBP1c蛋白顯著增高(P>0.05)，與模型組相比，水飛薊賓葡甲胺各組的LXRα及SREBP1c蛋白顯著降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性關系(P<0.05)，見圖1。

2.5 水飛薊賓葡甲胺鹽對肝纖維化大鼠肝HE染色的影響 模型組大鼠的肝小葉消失，中度增生的顯微組織將肝小葉分為不同的假小葉，大部分肝細胞明顯脂肪變性，點灶狀壞死，水飛薊賓葡甲胺各組的肝組織，肝小葉恢復，肝細胞脂肪變性改善，壞死點灶明顯減少，呈劑量依賴性關系，見圖2。

表3 水飛薊賓葡甲胺鹽對肝纖維化大鼠肝功能的影響

Tab.3 Effect of Silybinin meglumine on liver function of hepatic fibrosis rats

GroupsALT(U/L)AST(U/L)ALB(g/L)TBIL(μmol/L)Controlgroup35.61±10.42 62.45±24.3840.12±5.3320.34±8.91Modelgroup496.82±105.741)427.65±107.991) 21.54±10.191) 62.48±22.321)Silibininmegluminelowdosegroup372.65±101.232)317.41±95.372)26.84±8.6250.62±10.94Silibininmegluminemiddledosegroup215.69±84.272)3)195.72±64.912)3)30.15±5.692) 42.69±11.502)Silibininmegluminehighdosegroup108.45±51.272)3)4) 99.37±27.312)3)4)32.46±10.192) 33.90±10.272)3)F57.0542.966.9213.67P1.71E-178.09E-151.97E-42.27E-7

Note：Compared with control group,1)P<0.05；compared with model group,2)P<0.05；compared with low dose Silybinin meglumine,3)P<0.05；compared with middle dose Silybinin meglumine,4)P<0.05.

表4 水飛薊賓葡甲胺鹽對肝纖維化大鼠血脂的影響

Tab.4 Effect of Silybinin meglumine on blood lipid of hepatic fibrosis rats

GroupsTG(mmol/L)TC(mmol/L)LDLC(mmol/L)Controlgroup0.54±0.100.40±0.110.58±0.27Modelgroup1.25±0.341)1.05±0.241)3.14±0.951)Silibininmegluminelowdosegroup1.10±0.210.81±0.202)2.89±0.72Silibininmegluminemiddledosegroup0.92±0.132)0.75±0.122)3)2.43±0.532)3)Silibininmegluminehighdosegroup0.75±0.122)3)4)0.61±0.092)3)4)1.07±0.312)3)4)F9.8621.9733.57P6.91E-54.18E-105.55E-13

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05;compared with low dose Silybinin meglumine,3)P<0.05;compared with middle dose Silybinin meglumine,4)P<0.05.

圖2 水飛薊賓葡甲胺鹽對肝纖維化大鼠肝HE染色的影響(×200)Fig.2 Effect of Silybinin meglumine on liver pathology of hepatic fibrosis rats(×200)

圖1 水飛薊賓葡甲胺鹽對肝纖維化大鼠肝組織的LXRα及SREBP1c蛋白表達的影響Fig.1 Effect of Silybinin meglumine on LXRα and SREBP1c expression in liver tissue of hepatic fibrosis ratsNote: Compared with control group,*.P<0.05；compared with model group,#.P<0.05；compared with low dose Silybinin meglumine,△.P<0.05.

3 討論

LXRα在肝臟有表達，與肝臟的甘油三酯(TG)合成、脂肪形成和炎癥因子調節密切相關，給予高膽固醇喂食的LXRα-/-小鼠的肝組織顯微可見大量膽固醇，可見LXRα與肝纖維化發生發展緊密相連，隨著肝纖維化病變加重，LXRα表達也顯著增多[8-10]，同時LXRα過表達可與LXRα的配體類視黃醇 X 受體結合成異二聚體，激活成脂基因SREBP-1c過量表達，SREBP1c作為脂肪合成相關基因轉錄的決定子，調節脂肪代謝相關酶如脂肪合成酶、3-磷酸甘油酞基轉移酶等基因表達來調控體內的脂肪合成，參與肝臟TG合成，但SREBP1c表達一般不會受正常飲食干擾，LXRα與SREBP1c共同過量表達可加速肝臟生成大量脂肪酸，引起肝細胞脂肪變性，進一步加重肝纖維化，這也就解釋了肝纖維化大鼠外周血的血脂增高、肝功能降低及顯微的脂質病理變化，體外試驗顯示，抑制SREBP1c表達可限制下調脂質合成基因表達，因此SREBP1c表達調控是治療肝纖維化的新藥靶向參考[11-13]。給予水飛薊賓葡甲胺鹽后，肝組織的LXRα與SREBP1c表達明顯降低，呈劑量依賴性關系，提示水飛薊賓葡甲胺鹽可能通過阻斷或降低LXRα與SREBP1c的過表達，進而抑制脂肪酸與TG合成，減少肝細胞的脂肪水平，改善血脂紊亂，延緩肝纖維化進程，達到保肝的作用。對于水飛薊賓葡甲胺鹽與LXRα與SREBP1c表達的關聯度鮮有文獻報道，體外試驗甚至獲得了相反的結論，如高糖環境下水飛薊賓可顯著上調Insig-1和SREBP1c蛋白表達，Insig-1和SREBP1c兩者表達呈正相關關系，但筆者認為該結果的可信度因水飛薊賓的水不溶性和脂不溶性的理化性質而倍受質疑。因此該課題可能在發掘水飛薊賓葡甲胺鹽對于肝纖維化的作用靶點方面有了突破性進展。另一方面，從水飛薊賓葡甲胺鹽具有阻斷或降低SREBP1c過表達的作用來看，因高胰島素血癥可延遲SREBP1c前體剪切加工，因此高胰島素血癥患者也呈現SREBP1c高表達，這一點也提示水飛薊賓葡甲胺鹽可能對高胰島素血癥具有輔助治療作用。

綜上所述，水飛薊賓葡甲胺鹽具有治療肝纖維化的作用，在改善肝功能和降低血脂方面具有顯著優勢，與降低肝組織的LXRα和SREBP1c表達有關，但降低上述兩種蛋白的機理仍有待進一步考察。

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[收稿2016-04-26 修回2016-06-22]

(編輯 倪 鵬)

Efficacy of Silybinin meglumine on hepatic fibrosis rats and possible mechanisms

CHENYing-Kang,SHEFu-Qiang，LIUDa-Teng,ZHUJian-Chao,LIUYan,TIANPei-Yan.

QiannanMedicalCollegeforNationalities,Nanzhou558000,China

Objective:To investigate the efficacy of Silybinin meglumine on hepatic fibrosis rats and possible mecha-nisms.Methods: The liver fibrosis rats were randomly divided into 4 groups,the model group,Silybinin meglumine 120 mg/kg group,Silybinin meglumine dose group 60 mg/kg and Silybinin meglumine low dose group 30 mg/kg,and the control group.All groups had been treated for 4 groups.Results: No deaths rat.Compared with the control group,the reduced body weight,less dynamic,dark hair,decreased liver and spleen indexes,increased ALT,AST,TBIL,TG,TC and LDLC,and the decreased ALB, and the increased LXRα and SREBP1c had been observed in the model group(P<0.05).Compared with the model group,better activity and body weight,the increased liver and spleen indexs decreased ALT,AST,TBIL,TG,TC and LDLC,and the increased ALB, and the decreased LXRα and SREBP1c had been observed in the Silybinin meglumine groups(P<0.05),in a way of dose-depended.Conclusion: The Silibinin meglumine can treat liver fibrosis,by improving liver function,lowing lipid and decreaseing LXRα and SREBP1c expression in liver tissue.But the mechanism of two proteins reduced remains for further investigation.

Silibinin meglumine;Liver fibrosis;Hepatic function;Lipids;Liver tissue protein

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.009

①本文為黔南民族醫學高等專科學校科研基金項目(No.QNYZ 2013字2號)。

陳應康(1970年-)，男，副教授，主要從事病理毒理學方面研究，E-mail：ccyykk_144@163.com。

R285.5

A

1000-484X(2017)03-0360-05