KD患兒Th17/Treg細胞失衡和單核細胞趨化蛋白1的關系研究

夏 琨 王瑞耕 劉 玲 孫東明

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢兒童醫院,武漢430016)

KD患兒Th17/Treg細胞失衡和單核細胞趨化蛋白1的關系研究

夏 琨 王瑞耕 劉 玲 孫東明

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢兒童醫院,武漢430016)

目的：探討川崎病(KD)患兒外周血CD4+CD25+調節T細胞(Treg)/輔助性T 細胞17(Th17)與單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)的關系及其在KD發病中的作用機制。方法：2014年6月至2015年6月選取本院收治的48例KD患兒(恢復期 28例，急性期20例)為研究對象，另選取40例健康體檢兒童為對照組，采用ELISA法測定兩組血清中白細胞介素-15,17,23(IL-15,17,23)及MCP-1水平，采用流式細胞術測定兩組外周血Treg/Th17細胞比例。結果：KD組患兒血清IL-15、IL-17、IL-23及MCP-1水平顯著高于對照組(P<0.05)，且急性期KD患兒血清IL-15、IL-17、IL-23及MCP-1水平高于穩定期組。 KD組患兒Treg細胞、Treg/Th17、Th17顯著高于對照組(P<0.05)，急性期KD患兒Treg細胞、Treg/Th17水平、Th17高于穩定期(P<0.05)。經Pearson單因素分析，IL-15、IL-17、IL-23及MCP-1與Treg/Th17呈負相關(P<0.05)。結論：Treg與Th17細胞間的失衡及MCP-1水平在KD患兒體內持續升高可能與KD病情發病及進展有密切的關系，通過測定KD患兒Treg/Th17細胞比例及MCP-1對評估患兒病情及預后具有一定的指導意義。

川崎病；Treg細胞；單核細胞趨化蛋白1

川崎病(Kawasaki disease，KD)是兒科常見的急性發熱性出診性疾病之一，患兒病理特征為中小動脈免疫性血管炎合并冠狀動脈擴張、心肌梗死及猝死[1]。KD患兒急性期超抗原激活自身免疫反應導致大量炎癥介質及細胞因子釋放至血液中可導致小血管內皮壞死，進而引起患兒各種并發癥[2]。目前關于KD發病機制尚不明確，但有目前普遍認為Treg/Th17細胞失衡與KD的發生有密切的關系[3]。近年有研究指出單核細胞趨化蛋白1(Monocyte chemotactic protein，MCP-1)具有調節單個核細胞黏附及進入動脈壁的雙重功能[4]。因此，本研究將探討KD患兒外周血CD4+CD25+調節T細胞(regulatory T cells，Treg)與MCP-1的關系及其在KD發病中的作用機制，旨在為KD臨床防治提供指導。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2014年6月至2015年6月選取本院收治的48例KD患兒為研究對象，納入標準：(1)患兒均符合日本川崎病中心2002年修訂的診斷標準；(2)均簽署知情同意書。排除臨床感染性發熱、心血管疾病、血液腫瘤疾病患兒。其中男 26例，女22例，年齡1個月～8歲，平均年齡(3.25±0.89)歲，其中恢復期 28例，急性期20例。另選取40例健康體檢兒童為對照組，其中男 22例，女18例，年齡6個月～9歲，平均(3.69±1.12)歲，兩組患兒性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

(1)KD患兒于入院次日清晨抽取靜脈血3 ml，離心處理后留取上清液，對照組于檢查當天抽取靜脈3 ml,離心處理后留取上清液，并采用ELISA法測定兩組IL-15、IL-17、IL-23及MCP-1水平，IL-15試劑盒由上海拜力生物科技有限公司提供，IL-17試劑盒由上海圻明生物科技有限公司提供，IL-23試劑盒由上海酶聯生物科技有限公司提供，MCP-1試劑盒由上海盈公生物技術有限公司提供，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行操作。(2)Treg/Th17細胞測定：采用流式細胞儀測定外周血CD4+Th17、Th17/Treg 、CD4+CD25+Treg比率。

2 結果

2.1 兩組外周血IL-15、IL-17、IL-23及MCP-1水平對比 KD組患兒血清IL-15、IL-17、IL-23及MCP-1水平顯著高于對照組(P<0.05)，且急性期KD患兒血清IL-15、IL-17、IL-23及MCP-1水平高于穩定期組，見表1。

2.2 兩組外周血Treg/Th17水平對比 KD組患兒Treg細胞、Treg/Th17、Th17顯著高于對照組(P<0.05)。急性期KD患兒Treg細胞、Treg/Th17水平、Th17高于穩定期(P<0.05)，見表2，圖1、2。

2.3 MCP-1與外周血Treg/Th17細胞比例的關系研究 經Pearson單因素分析，IL-15、IL-17、IL-23及MCP-1與Treg/Th17成負相關(P<0.05)，見表3。

GroupsnIL-15IL-17IL-23MCP-1KDchildren Acutephasegroup2028.63±4.891)2)30.45±5.621)2)28.25±6.321)2)412.36±42.421)2) Stablephasegroup2817.98±5.361)24.58±6.321)20.78±5.361)202.36±8.691)Normalcontrolgroup4012.02±3.4820.12±5.6917.47±4.2245.36±20.12Fvalue22.36225.25630.25224.522Pvalue0.0000.0000.0000.000

Note：Compared with the stable phase group,1)P<0.05;compared with the normal control group,2)P<0.05.

GroupsnTh17cell(%)Tregcell(%)Th17/Treg(%)KDchildren Acutephasegroup206.96±1.021)2)5.36±0.861)2)1.48±0.261)2) Stablephasegroup283.32±0.861)4.78±0.721)0.82±0.321)Normalcontrolgroup401.82±0.120.55±0.140.45±0.11Fvalue9.1237.8236.452Pvalue0.0000.0000.000

Note：Compared with the stable phase group,1)P<0.05;compared with the normal control group,2)P<0.05.

圖1 患兒Th17細胞流式散點圖Fig.1 KD children Th17 cells flow scatterplotNote: A.Normal control group；B.KD children with stable phase；C.KD acute phase.

圖2 患兒Treg細胞流式散點圖Fig.2 KD children Treg cells flow scatterplotNote: A.Normal control group；B.KD children with stable phase；C.KD acute phase.

表3 MCP-1與外周血Treg/Th17細胞比例的關系研究

Tab.3 Relationship between MCP-1 and peripheral Treg/Th17 cells in proportion

CellsIL-15IL-17IL-23MCP-1Th17cell0.11000.00180.12300.1450Tregcell0.11900.12500.13600.1480Th17/Treg0.32501)0.33801)0.31401)0.33601)

Note：1)P<0.05.

3 討論

KD是兒童常見的免疫相關性血管炎癥綜合征，近年研究指出，KD患兒普遍存在冠狀內皮功能異常并持續存在且呈彌散性分布的情況，而炎癥性血管疾病是由受感染血管壁細胞與免疫細胞相互作用并維持的，因此選擇靈敏度及特異度較高的血管炎癥標準物將有助于對KD患兒早期診斷、預后及監測[5]。Guo等[6]對KD患兒冠狀動脈進行病理檢查發現血管中存在大量單核細胞浸潤。盧紅飛等[7]研究也指出，單核細胞在KD發病及病情進展中起到重要的作用。MCP-1屬于趨化因子中的一員，具有趨化單個核細胞、淋巴細胞及自然殺傷細胞的功能。本研究結果顯示，KD組患兒血清MCP-1水平顯著高于對照組，且急性期KD患兒血清MCP-1水平高于穩定期組，對這種現象的解析是MCP-1參與了KD冠狀動脈患者發病過程，并在體內持續較長的時間，并在KD患兒體內強烈表達，從而導致KD患兒急性期患兒血清中MCP-1水平較高[8]。

目前認為T淋巴細胞免疫功能紊亂與KD的發生及病情進展有密切的關系，免疫系統高度活化及免疫損傷性血管炎是KD的兩大免疫特征，由此可以推測免疫功能紊亂在KD發生及進展中扮演重要的角色[9]。Treg細胞屬于免疫調節功能T細胞亞群，主要表達細胞表面分子CD4+CD5+，其主要作用為抑制機體病理性免疫反應，介導自身免疫反應，從而維持機體內環境穩定性及免疫系統功能[10]。本研究結果顯示，KD患兒外周血腫Treg水平顯著低于對照組，且急性KD患兒顯著低于恢復期，結果與既往研究一致，進一步表明Treg細胞在KD患兒中存在異常，導致對感染引起的效應性促炎癥因子激活、T細胞活化及非特異性免疫性應答增強等免疫活化反應受到抑制，從而導致機體各系統尤其是血管系統損傷。

Th17是近年新發現的新型CD4+T細胞亞型。Th17細胞及其分泌的炎癥相關因子如IL-15、IL-17、IL-23可參與機體炎癥反應，并對多種免疫性疾病具有促進作用[11]。國外研究指出，在炎癥行疾病患者體內血清IL-15、IL-17、IL-23顯著高于正常人群[12]，在支氣管哮喘小鼠模型中從肺臟組織及呼吸道灌液中明顯可以檢測Th17細胞及其炎癥相關細胞水平顯著升高。本研究結果發現，KD患兒外周血腫Th17水平顯著高于對照組，急性期KD患兒血清Th17水平顯著高于穩定期，這提示KD患兒體內Th17水平升高可能與其KD患兒病情發生及進展有密切的關系。經Pearson單因素分析，IL-15、IL-17、IL-23及MCP-1與Treg/Th17成負相關(P<0.05)，提示KD的發生除了與患兒自身免疫系統功能異常有關外，還可能與單核趨化細胞分泌異常有密切的關系，KD的發生不是單因素引起的，可能是由多個危險因素相互作用相互影響引起的，這在日后還需要擴大樣本量進一步研究。

綜上所述，Treg與Th17細胞間的失衡及MCP-1水平在KD患兒體內持續升高可能與KD病情發病及進展有密切的關系，通過測定KD患兒Treg/Th17細胞比例及MCP-1對評估患兒病情及預后具有一定的指導意義。

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[收稿2016-04-11 修回2017-02-03]

(編輯 張曉舟)

Relationship between Th17/Treg cells and monocyte chemoattractant protein-1 in KD children

XIAKun,WANGRui-Geng,LIULing,SUNDong-Ming.

WuhanChidren′sHospital，TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScience&Technology,Wuhan430016,China

Objective:To investigate the relationship between CD4+CD25+regulatory T cells (Treg) and monocyte chemoattractant protein-1 and its mechanism in KD pathogenesis.Methods: 48 patients of KD (28 cases of recovery,20 cases of acute phase) were admitted from June 2014 to June 2015 and the other 40 cases of healthy children was admitted to control group.The levels of serum interleukin-15,17,23 (IL-15,17,23) and MCP-1 of two groups were measured with ELISA.The levels of Treg/Th17 cell ratio of two groups were measured with flow cytometry.Results: The levels of IL-15,IL-17,IL-23 and MCP-1 of KD group were higher than control groups(P<0.05) and the levels of IL-15,IL-17,IL-23 and MCP-1 of acute phase groups were higher than recovery groups.The levels of Th17,Treg cells,Th17/Treg of KD group were lower than the control group (P<0.05),while the levels of Th17,Treg cells,Th17/Treg cells in the acute phase of KD patients were higher than stable phase.The levels of IL-15,IL-17,IL-23 and MCP-1 and Treg/Th17 were negative correlation with univariate analysis by Pearson(P<0.05).Conclusion: The imbalance between Treg and Th17 cells and MCP-1 levels continue to rise may be associated with KD onset and progress of the disease is closely related to children in KD vivo by measuring children with KD Treg/Th17 cells and MCP-1 ratio of assessment Children with the condition and prognosis has some significance.

Kawasaki disease;Treg cells;Monocyte chemoattractant protein-1

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.024

夏 琨(1977年-)，女，主治醫師，主要從事兒童心血管疾病方面的研究。

及指導教師：孫東明(1971年-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事兒童心血管疾病方面的研究。

R725.9

A

1000-484X(2017)03-0429-04