花類藥材金銀花精準(zhǔn)煮散飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)＊

任之堯，徐 文，張 靖，蘇 賀，董林林，徐 江，丘小惠＊＊，黃志海＊＊

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院/中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣東分院 廣州 510006；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

花類藥材金銀花精準(zhǔn)煮散飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)＊

任之堯1，徐 文1，張 靖1，蘇 賀1，董林林2，徐 江2，丘小惠1＊＊，黃志海1＊＊

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院/中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣東分院 廣州 510006；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

目的：飲片質(zhì)量均一性是中藥穩(wěn)定臨床療效的基礎(chǔ)。本文基于成分分析與DNA分子鑒定手段，考察金銀花精準(zhǔn)準(zhǔn)煮散飲片與市售原飲片質(zhì)量差異，探索精準(zhǔn)煮散飲片的質(zhì)量控制方法。方法：應(yīng)用ITS2序列作為DNA條形碼對(duì)金銀花飲片進(jìn)行鑒定；對(duì)比金銀花市售原飲片及精準(zhǔn)煮散飲片的干膏收率；采用HPLC-DAD法進(jìn)行3批次飲片混合粉碎前后指標(biāo)成分含量、指紋圖譜及相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果：金銀花煮散飲片出膏率及指標(biāo)成分綠原酸含量均略高于市售飲片；市售飲片綠原酸的批間溶出量有明顯的差異性，RSD為11.93%；混合制成煮散飲片后差異降低，RSD為8.29%。指紋圖譜相似度結(jié)果顯示，混合粉碎后指紋圖譜相似度提高，標(biāo)定共有峰7個(gè)，峰面積均有不同程度提高。結(jié)論：金銀花精準(zhǔn)煮散飲片與市售原飲片基本屬性相一致，但煮散飲片的出膏率、成分溶出及質(zhì)量均一性均有明顯提高，表明煮散飲片有較好的臨床應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。

金銀花 精準(zhǔn)煮散飲片 DNA條形碼 指紋圖譜

金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱等功效，可用于癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫?zé)岚l(fā)病[1]。藥理研究顯示，金銀花有解熱、抗炎、抗氧化、抗菌、抗真菌、抗病毒、保肝、抗生育、止血、降壓和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[2-4]?；瘜W(xué)成分研究方面，金銀花具有酚酸、環(huán)烯醚萜苷、黃酮、皂苷和等多種結(jié)構(gòu)類型的化合物，其中綠原酸和木犀草苷是其重要的藥理活性成分，并作為目前金銀花藥材和相關(guān)制劑的質(zhì)量控制成分[5，6]。

金銀花生藥材商品的植物來源十分復(fù)雜，忍冬屬植物的花蕾作為金銀花生藥材商品的約有18種，民間用藥更是來源廣泛。《中國(guó)藥典》1977年始，金銀花藥材來源由僅有的忍冬，增加了紅腺忍冬、山銀花（華南忍冬）、毛花柱忍冬。2005年版以后將金銀花分列為金銀花和山銀花，除忍冬作為金銀花的唯一來源，山銀花的來源則為灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬或黃褐毛忍冬[7]。金銀花來源復(fù)雜，產(chǎn)地不同，加工方法各異，質(zhì)量參差不齊，導(dǎo)致金銀花飲片批間、批內(nèi)質(zhì)量不均一，直接影響臨床用藥療效的穩(wěn)定。

根據(jù)本課題組前期提出的“精準(zhǔn)煮散飲片”理論體系[8]，我們將進(jìn)行金銀花煮散飲片研制研究，經(jīng)規(guī)范化工藝將金銀花飲片的形狀規(guī)格微小化、均勻化處理，使飲片批內(nèi)質(zhì)量均一化，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、高效的自動(dòng)化分裝、調(diào)劑、煎煮流程，提高臨床湯劑用藥的精準(zhǔn)性。源于先秦至唐宋時(shí)期盛行的中藥煮散，是將中藥材粉碎成粗顆?；虼址墼僖运逯螅淙秉c(diǎn)在于藥材形態(tài)破壞，藥物鑒別特征喪失，導(dǎo)致“辨藥之難”，因而逐步被中藥飲片所取代[9，10]。中藥DNA條形碼鑒定體系[11-14]以及中藥指紋圖譜技術(shù)的有效結(jié)合，可促進(jìn)中藥質(zhì)量控制體系精準(zhǔn)化，利于中藥識(shí)別溯源與檢測(cè)，可有效解決傳統(tǒng)煮散的“辨藥之難”。本文以金銀花飲片規(guī)格、含量均勻度、指紋圖譜與相似度評(píng)價(jià)、DNA序列比對(duì)為考查重點(diǎn)，對(duì)金銀花精準(zhǔn)煮散飲片的質(zhì)量開展系統(tǒng)評(píng)價(jià)，以期揭示精準(zhǔn)煮散飲片應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)中藥飲片的質(zhì)量均一化，從而提高中醫(yī)臨床療效的穩(wěn)定性。

1 儀器與材料

美國(guó)Agilent 1260型高效液相色譜儀（四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器及DAD檢測(cè)器），臺(tái)灣榮聰鐵工廠粉碎機(jī)，BT 125 D十萬(wàn)分之一分析天平，HTP-312電子天平，Centrifuge 5430R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，DK-S26電熱水浴鍋。ProFlex型PCR儀（美國(guó)Life Technologies公司，型號(hào)：ProFlex），Mini-Sub Cell GT型水平電泳槽（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：Mini-Sub Cell GT），GelDoc XR+型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：GelDoc XR+），NanoDrop 2000c型分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Scientific公司，型號(hào)：NanoDrop 2000c）。

圖1 金銀花原飲片及煮散飲片形態(tài)

綠原酸對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)生物制品鑒定所（批號(hào)：110753-201415）。3批金銀花飲片均購(gòu)置于康美藥業(yè)，產(chǎn)地河南，批號(hào)分別為：1608001、160204281、160707361（S1-S3）。色譜甲醇、乙腈為德國(guó)默克公司生產(chǎn)，其他試劑為分析純，煎煮用水為蒸餾水、液相用水為美國(guó)millipore制備純水。

DP305植物基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，批號(hào)：P4104）；Tris（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：V900483）；β-巰基乙醇（美國(guó)Sigma，批號(hào)：M6250）；DL 2000 DNA Marker（日本TaKaRa公司，批號(hào)：P4219）；Tris-HCl（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：T818979）；瓊脂（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：V900500）；Glodview（上海賽百盛基因技術(shù)有限公司，批號(hào)：20151209）；引物由上海美吉生物科技有限公司合成；2×Tap PCR Mix酶（北京艾德萊生物科技有限公司，批號(hào)：262451AX）。

2 方法與結(jié)果

2.1 飲片制備

取金銀花市售飲片（S2）用粉碎機(jī)粉碎均勻，混合，過篩，得5-10目（2-4 mm）、10-24目（0.8-2.0 mm）、24-65目（0.25-0.80 mm）等不同規(guī)格的煮散飲片，用于出膏率比較研究。另取不同批次原飲片（S1-S3）各取20 g，另分別取3個(gè)批次市售飲片各200 g，充分混合后，粉碎，過篩，取10-65目粒徑范圍的煮散飲片，混勻后均勻攤平，畫格分為9份，隨機(jī)選取3份（S4-S6），從每份中分別稱取20 g，用于質(zhì)量均一性研究。市售傳原飲片及煮散飲片形態(tài)見圖1。

2.2 DNA 條形碼檢測(cè)方法

選取S1-S6飲片樣本各約40 mg，用組織研磨儀磨碎，采用植物DNA提取試劑盒提取基因組總DNA。ITS2序列擴(kuò)增采用正向引物ITS2F：5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’，反向引物：ITS3R：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’，進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括2×Taq PCR Mix酶 12.5 μL，正向、反向引物各1 μL （2.5 μmol·L-1），模板DNA 2.0 μL（約30-100 ng），加ddH2O補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增程序：94℃變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s（40個(gè)循環(huán)）；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，將電泳條帶清晰、明亮、單一的PCR產(chǎn)物送測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序。所得序列采用CodonCode Alinger 6.02軟件進(jìn)行校對(duì)拼接，去除低質(zhì)量區(qū)并采用基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8S和28S區(qū)段，獲得完整的ITS2序列。利用軟件MEGA 6.06分析比對(duì)，分析ITS2序列特點(diǎn)[15]。

應(yīng)用MEGA 6.06分析淫羊藿3條ITS2序列特征，發(fā)現(xiàn)種內(nèi)存在1個(gè)變異位點(diǎn)，為69位點(diǎn)C/T突變。3條金銀花序列長(zhǎng)度均為228 bp，A、C、G、T的堿基平均含量分別為11.84%、41.08%、34.21%、12.87%，GC含量達(dá)75%。以條形碼附加二維碼的方式展示主導(dǎo)單倍型序列特征，左側(cè)部分為DNA序列轉(zhuǎn)換的彩色條形碼圖片，右側(cè)二維碼圖片為QRcode的編碼方式進(jìn)行編碼，掃描可讀取序列信息，典型序列特征見圖2。BLAST搜索結(jié)果顯示各樣品相似性最高的為忍冬L. japonica，與其最相似序列的相似度為100%。

2.3 出膏率考察

分別稱取2.1項(xiàng)下不同規(guī)格煮散飲片及原飲片100 g，分別加12倍量水，先浸泡30 min，煮沸30 min，過濾分離出煎煮液，再加10倍量水煎煮30 min。合并煎煮液，濃縮成100 mL溶液，即濃縮為1 g·mL-1的原藥材溶液。精密吸取25 mL于蒸發(fā)皿中，60℃真空干燥至恒重，稱量重量，根據(jù)出膏率公式計(jì)算出膏率。不同粉碎目數(shù)下的煎煮出膏率結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，與原飲片比較，粉碎后不同粒徑煮散飲片的出膏率均有一定程度增加；但不同粒徑的出膏率差異不明顯。另外，如果飲片粉碎過細(xì)（小于65目），在煎煮過程中容易產(chǎn)生糊化現(xiàn)象。

2.4 飲片質(zhì)量均一性考察

2.4.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱取綠原酸對(duì)照品適量，加入50%甲醇配制成40 μg·mL-1對(duì)照品溶液，過0.22 μL微孔濾膜，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 市售原飲片與不同粉碎度煮散飲片的出膏率（s，n=3）

表1 市售原飲片與不同粉碎度煮散飲片的出膏率（s，n=3）

飲片規(guī)格出膏率（n=3）澄清度市售原飲片31.38±0.51 +++ 5-10目（2-4 mm）35.28±3.20 +++ 10-24目（0.8-2.0 mm）33.23±1.13 +++ 24-65目（0.25-0.80 mm）34.47±3.14 ++

圖2 金銀花ITS2序列

圖3 綠原酸對(duì)照品HPLC-DAD色譜圖

圖4 金銀花飲片HPLC-DAD色譜圖

表2 金銀花飲片綠原酸煎煮提取率結(jié)果（n=3）

表3 指紋圖譜實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相梯度條件

2.4.2 供試品溶液制備

上述6份樣品按2.3項(xiàng)下方法煎煮。合并煎煮液，濃縮成100 mL溶液，即濃縮為0.2 g·mL-1的原藥材溶液。取各飲片（S1-S6）提取濃縮液2.5-10 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，即得供試品溶液，進(jìn)樣前用0.22 μm濾膜過濾。

2.4.3 飲片提取液中綠原酸含量測(cè)定

采用高效液相方法測(cè)定，色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（45 μm，4.6 mm×250 mm）。檢測(cè)方法按照《中國(guó)藥典》2015年版一部金銀花項(xiàng)下含量測(cè)定方法測(cè)定市售飲片及煮散飲片提取液中綠原酸的含量。對(duì)3批金銀花原飲片及其粉碎混合后的煮散飲片進(jìn)行均一性比較，對(duì)照品及樣品溶液HPLC-DAD色譜圖分別見圖3、圖4。對(duì)6份金銀花樣品進(jìn)行測(cè)定，各飲片的綠原酸含量測(cè)定結(jié)果如表2。結(jié)果表明，金銀花3批市售飲片經(jīng)均一化處理后，綠原酸含量RSD下降，說明均一度得到提高，且樣品經(jīng)過粉碎處理后，指標(biāo)成分綠原酸的含量也得到提高，結(jié)果有顯著性差異（P＜0.05）。

圖5 市售原飲片及混合后精準(zhǔn)煮散飲片HPLC指紋圖譜

2.5 飲片指紋圖譜比較

2.5.1 指紋圖譜測(cè)定條件

采用高效液相方法測(cè)定，色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（45 μm，4.6 mm×250 mm）。流動(dòng)相由乙腈（A）和0.5%乙酸水（B）組成，洗脫梯度如表3；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，流速為1 mL·min-1，進(jìn)樣量為5 μL。

2.5.2 金銀花原飲片與煮散飲片指紋圖譜比較

取上述藥材，按指紋圖譜測(cè)定方法檢測(cè)，金銀花煎煮液主要色譜峰指紋圖譜見圖5。采用國(guó)家藥典委員會(huì)2014年版指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件比較市售飲片混合前后指紋圖譜相似度，見表4。結(jié)果顯示在現(xiàn)有的檢測(cè)方法下，市售飲片與經(jīng)粉碎混勻得金銀花煮散飲片樣品共6批樣品的主要色譜峰均可以良好的匹配，相似度分析結(jié)果顯示所有樣品的相似度均在0.99以上，表明采用指紋圖譜相識(shí)度分析方法可以用于金銀花煮散飲片的真?zhèn)舞b別。

進(jìn)一步比較原飲片與煮散飲片7個(gè)共有峰相對(duì)峰面積，如下表所示，結(jié)果表明經(jīng)粉碎混勻處理的金銀花煮散飲片（S4-S6）7個(gè)共有峰的平均峰面積均高于未粉碎前樣品（S1-S3），進(jìn)一步說明制備煮散飲片能提高有效成分的的浸出率。

3 討論

綠原酸和木犀草苷是現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》規(guī)定的金銀花飲片測(cè)量指標(biāo)成分，其含量分別不得少于1.500%和0.050%。由于水提液中綠原酸提取率較高，因而本文以綠原酸作為測(cè)定飲片溶出的指標(biāo)成分，其余成分比較煮散飲片制備前后共有峰的峰面積。本文采用HPLC-DAD含量測(cè)定法、指紋圖譜分析分析法以及DNA條形碼技術(shù)定性定量比較金銀花市售飲片與煮散飲片質(zhì)量差異。結(jié)果表明，金銀花的煮散飲片與其原市售飲片具有屬性的一致性，二者在成分的種類上未有明顯改變，但指標(biāo)成分綠原酸及大多數(shù)共有峰的提取率有不同程度提升，且均一性明顯提高。

表4 金銀花280 nm指紋圖譜相似度結(jié)果

精準(zhǔn)煮散飲片與傳統(tǒng)中藥煮散的物質(zhì)形態(tài)并無(wú)不同，僅改變了中藥飲片的形狀規(guī)格，使其微小化、均一化，但其內(nèi)涵[8]超越了傳統(tǒng)中藥煮散，可實(shí)現(xiàn)飲片質(zhì)量均一化，使中藥劑量和湯劑質(zhì)量更加精準(zhǔn)、穩(wěn)定。同時(shí)，也能提高中藥資源的合理利用，在藥量更少的情況下煮散可達(dá)到常規(guī)飲片同樣的臨床治療效果。此外，中藥DNA條形碼鑒定體系與中藥指紋圖譜技術(shù)的發(fā)展，解決了傳統(tǒng)煮散的“辨藥之難”問題，能有效實(shí)現(xiàn)煮散飲片的精準(zhǔn)化鑒定和檢測(cè)，為精準(zhǔn)煮散飲片的應(yīng)用與推廣提供可靠的技術(shù)支持與保障。

表5 共有峰峰面積比較

參考文獻(xiàn)

1 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典一部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015：221.

2 Xu Y, Oliverson B G, Simmons D L. Trifunctional inhibition of COX-2 by extracts of Lonicera japonica: direct inhibition, transcriptional and post-transcriptional down regulation.J Ethnopharmacol, 2007, 111(3)：667-670.

3 馬雙成,劉燕,畢培曦,等.金銀花藥材中抗呼吸道病毒感染的黃酮類成分的定量研究.藥物分析雜志,2006,26(4)：426-430.

4 Sun C, Teng Y, Li G,et al. Metabonomics study of the protective effects ofLonicera japonicaextract on acute liver injury in dimethylnitrosamine treated rats.J Pharm Biomed Anal, 2010, 53(1)：98-102.

5 辛華,豐杰,程若敏,等. HPLC測(cè)定不同產(chǎn)地金銀花中綠原酸和木犀草苷.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(2)：60-63.

6 韓永成.金銀花藥材質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)研究.鄭州:河南中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文,2014：32.

7 王亞丹,楊建波,戴忠,等.中藥金銀花的研究進(jìn)展.藥物分析雜志,2014,16(11)：1928-1935.

8 陳士林,黃志海,丘小惠,等.中藥精準(zhǔn)煮散飲片.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2016,18(9)：1430-1440.

9 徐海波.中藥煮散源流考.河北中醫(yī)藥學(xué)報(bào),1999,14(4)：11-13.

10 劉起華,文謹(jǐn),章軍,等.根及根莖類中藥煮散與傳統(tǒng)飲片有效成分煎出量對(duì)比研究.中國(guó)新藥雜志,2014,23(5)：591-595,605.

11 Wang M, Zhao H X, Wang L,et al. Potential use of DNA barcoding for the identification of Salvia, based on cpDNA and nrDNA sequences.Gene, 2013, 528(2)：206-215.

12 Chen S, Pang X, Song, J,et al. A renaissance in herbal medicine identification: from morphology to DNA.Biotechnol Adv, 2014, 32(7)：1237-1244.

13 陳士林.中國(guó)藥典中藥材DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列.北京:科學(xué)出版社,2015：5-7.

14 陳士林,龐曉慧,姚輝,等.中藥DNA條形碼鑒定體系及研究方向.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2011,13(5)：747-754.

15 陳士林,姚輝,韓建萍,等.中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則.中國(guó)中藥雜志,2013,38(2)：54-61.

A Study on Quality of the Precise Powder Decoction Pieces of Medicinal Flowers Lonicerae japonicae Flos

Ren Zhiyao1, Xu Wen1, Zhang Jing1, Su He1, Dong Linlin2, Xu Jiang2, Qiu Xiaohui1, Huang Zhihai1
(1. The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangdong Provincial Academy of Chinese Medical Sciences, China Academy of Chinese Medical Sciences Guangdong Branch, Guangzhou 510006, China; 2. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)

This study aimed at evaluating the quality of the precise powder decoction pieces (PPDP) ofL. japonicaeFlos (LJF) compared with the traditional commercial slices with chemical fingerprint methods and DNA molecular identification technology. Different specifications of PPDP were prepared， their dry extract contents were in contrast with that of commercial slices. The three batches of commercial slices were collected， and the content uniformity， fingerprint and similarity evaluation before and after the mixing and pulverization were studied by HPLC-DAD and DNA sequence alignment. As a result， the paste rate of PPDP was slightly higher than that of the traditional commercial slices. The dissolution of chlorogenic acid of PPDP was higher than that of the traditional commercial slices. RSD of inter-assay dissolutions of chlorogenic acid of commercial slices was 11.93%， which was reduced to 8.29% after mixing and preparing into PPDP. The fingerprint showed that the slimilarity of the fringerprint of the mixed and powdered LJF was elevated with 7 common peaks. All the common peaks were increased at different levels. In conclusion， compared with traditional commercial slices of LJF， PPDP apparently improved the dissolution rate and the quality uniformity， indicating that the boiled powder of CRP obviously presented vantages in clinic.

Lonicerae japonicaeFlos， precise powder decoction pieces， DNA barcode， fingerprint

10.11842/wst.2017.01.013

R28

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-12-23

修回日期：2016-12-23

＊ 廣東省中醫(yī)院專項(xiàng)（2015KT1817）：嶺南中草藥DNA條形碼分子鑒定和生態(tài)適宜性研究，負(fù)責(zé)人：黃志海；中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥健康服務(wù)專項(xiàng)（ZZ0908067）：200種嶺南中草藥DNA條形碼研究，負(fù)責(zé)人：黃志海。

＊＊ 通訊作者：丘小惠，研究員，主要研究方向：中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究；黃志海，主任藥師，主要研究方向：中藥資源與中藥鑒定研究。