葉類藥材淫羊藿精準(zhǔn)煮散飲片的質(zhì)量研究＊

張 靖，徐 文，宮 璐，李西文，肖水明，徐 江，丘小惠＊＊，黃志海＊＊

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院/中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣東分院 廣州 510006；2. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

葉類藥材淫羊藿精準(zhǔn)煮散飲片的質(zhì)量研究＊

張 靖1，徐 文1，宮 璐1，李西文2，肖水明2，徐 江2，丘小惠1＊＊，黃志海1＊＊

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院/中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣東分院 廣州 510006；2. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

目的：采用化學(xué)指紋圖譜法結(jié)合DNA分子鑒定技術(shù)，考察淫羊藿精準(zhǔn)煮散飲片與市售原飲片質(zhì)量差異。方法：制備不同規(guī)格淫羊藿煮散飲片，對(duì)比市售飲片及煮散飲片的干膏收率；應(yīng)用ITS2及psbA-trnH條形碼序列對(duì)淫羊藿飲片進(jìn)行分子鑒定；采用HPLC-DAD法進(jìn)行3批次飲片混合粉碎前后質(zhì)量均一性、指紋圖譜及相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果：淫羊藿煮散飲片出膏率略高于市售飲片；3批市售飲片指標(biāo)成分淫羊藿苷提取率有明顯的差異性，RSD為15.56%，煮散飲片差異較小RSD為6.82%。指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，淫羊藿精準(zhǔn)煮散飲片的指紋圖譜相似度提高，標(biāo)定共有峰10個(gè)，峰面積均有提高。ITS2及psbA-trnH序列對(duì)淫羊藿煮散飲片可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確鑒定。結(jié)論：淫羊藿精準(zhǔn)煮散飲片與市售飲片基本屬性相一致，但煮散飲片的浸膏提取率、指標(biāo)成分的批間均一性有不同程度提升。研究結(jié)果顯示發(fā)展精準(zhǔn)煮散飲片有良好的應(yīng)用前景。

淫羊藿 精準(zhǔn)煮散飲片 DNA條形碼 指紋圖譜

中藥煮散是傳統(tǒng)中藥的藥用形式。先秦至唐宋時(shí)期盛行的中藥煮散，將中藥材粉碎成粗顆粒或粗粉，以水煎煮，去渣取汁或連同藥渣服用。煮散的粉碎過(guò)程破壞了藥材形態(tài)，導(dǎo)致“辨藥之難”，后逐步被具有藥物鑒別特征的中藥飲片所取代[1，2]。隨著現(xiàn)代中藥DNA條形碼鑒定體系及其二維碼技術(shù)的推廣與應(yīng)用，并且結(jié)合中藥指紋圖譜技術(shù)[3-6]，中藥質(zhì)量控制體系逐步精準(zhǔn)化，可提供精準(zhǔn)的中藥識(shí)別溯源與檢測(cè)，能有效解決傳統(tǒng)煮散的“辨藥之難”。由此本課題組提出“精準(zhǔn)煮散飲片”的概念與思路[7]，將中藥飲片的形狀規(guī)格微小化、均勻化處理，可使飲片批量規(guī)模穩(wěn)定化，批內(nèi)質(zhì)量均一化，提高臨床湯劑用藥的精準(zhǔn)性。

淫羊藿是現(xiàn)行藥典中規(guī)定來(lái)源物種最多的藥材之一，來(lái)源于淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim.、箭葉淫羊藿E. sagittatum(Sieb. et Zucc) Maxim.、柔毛淫羊藿E. pubescensMaxim和朝鮮淫羊藿E. koreanumMaxim.等4個(gè)種的干燥葉，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的作用[8]。淫羊藿對(duì)心腦血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和骨髓系統(tǒng)等均有一定的保健作用，具有增強(qiáng)免疫、鎮(zhèn)靜、抗抑郁、抑菌抗炎、抗病毒、抗腫瘤、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、抗骨質(zhì)疏松、抗氧化、抗衰老等多種生理活性[9-12]。淫羊藿中含有黃酮類化合物、多糖、生物堿、木脂素、萜類等多種結(jié)構(gòu)類型的化合物，其中黃酮類化合物為其主要起效成分，總黃酮及淫羊藿苷為現(xiàn)行藥典中淫羊藿的藥材和相關(guān)制劑的質(zhì)量控制成分[13-15]。

中國(guó)是世界淫羊藿物種的主要分布地，是國(guó)際淫羊藿藥材與提取物的主要供應(yīng)國(guó)。研究資料表明，淫羊藿屬植物共有56種，其中中國(guó)分布48種和3個(gè)變種。淫羊藿生藥材商品的植物來(lái)源復(fù)雜，在實(shí)際應(yīng)用中有20多種淫羊藿用于臨床實(shí)踐[16]。很多種淫羊藿的藥理活性成分含量很低，達(dá)不到《中國(guó)藥典》要求[17]。淫羊藿藥材質(zhì)量可能受到物種或品種、產(chǎn)地或生境、采摘或收獲時(shí)期、栽培技術(shù)等多種因素的影響，導(dǎo)致淫羊藿飲片質(zhì)量不均一，直接影響臨床用藥療效的穩(wěn)定。根據(jù)本課題組提出的“精準(zhǔn)煮散飲片”理論體系，本文將對(duì)淫羊藿煮散飲片進(jìn)行研究，以飲片規(guī)格、含量均勻度、指紋圖譜與相似度評(píng)價(jià)、DNA序列比對(duì)為考查重點(diǎn)，對(duì)淫羊藿精準(zhǔn)煮散飲片的質(zhì)量開(kāi)展系統(tǒng)評(píng)價(jià)，以期揭示精準(zhǔn)煮散飲片應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)中藥飲片的質(zhì)量均一化。

1 材料與儀器

圖1 淫羊藿原飲片及煮散飲片形態(tài)

色譜甲醇、乙腈為德國(guó)默克公司生產(chǎn)，其他試劑為分析純，煎煮用水為蒸餾水、液相用水為millipore制備純水。淫羊藿苷對(duì)照品購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司（批號(hào)：MUST-16101705）。3批淫羊藿飲片分別購(gòu)置于康美藥業(yè)（批號(hào)：160404531、160900951）和廣州至信藥業(yè)股份有限公司（批號(hào)：160202），產(chǎn)地依次為：甘肅、甘肅、江蘇。其他試劑為DP305植物基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，批號(hào)：P4104）；Tris（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：V900483）；β-巰基乙醇（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：M6250）；DL2000 DNA Marker（日本TaKaRa公司，批號(hào)：P4219）；Tris-HCl（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：T818979）；瓊脂（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：V900500）；Glodview（上海賽百盛基因技術(shù)有限公司，批號(hào)：20151209）；引物由上海美吉生物科技有限公司合成；2×Tap PCR Mix酶（北京艾德萊生物科技有限公司，批號(hào)：262451AX）。

美國(guó)Agilent 1260型高效液相色譜儀（四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器及DAD檢測(cè)器），BT 125 D型十萬(wàn)分之一分析天平（瑞士Mettler-toledo公司，型號(hào)：BT 125 D）、萬(wàn)分之一分析天平（德國(guó)Sartorius公司，型號(hào)：BS 224 S）、HTP-312電子天平（上海花潮電器有限公司）、DK-S26電熱水浴鍋（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、Centrifuge 5430R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)eppendorf公司），RT-35粉碎機(jī)（臺(tái)中市榮聰精密科技有限公司）、ProFlex型PCR儀（美國(guó)Life Technologies公司，型號(hào)：ProFlex）、Mini-Sub Cell GT型水平電泳槽（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：Mini-Sub Cell GT）、GelDoc XR+型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：GelDoc XR+）、NanoDrop 2000c型分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Scientific公司，型號(hào)：NanoDrop 2000c）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 不同規(guī)格飲片出膏率比較研究

取市售淫羊藿飲片（批號(hào)：160404531）經(jīng)粉碎均勻，過(guò)篩，分別得5-10目（2-4 mm）、10-24目（0.8-2.0 mm）、24-65目（0.25-0.80 mm）3種規(guī)格的煮散飲片。稱取上述煮散飲片各100 g，采用標(biāo)準(zhǔn)湯劑的方法[18]進(jìn)行煎煮。分別加12倍量水，先浸泡30 min，煮沸30 min，過(guò)濾分離出煎煮液，再加10倍量水煎煮30 min。合并煎煮液，濃縮成100 mL溶液，即為1 g·mL-1的藥材提取溶液。精密吸取25 mL于蒸發(fā)皿中，60℃真空干燥至恒重，稱量重量，根據(jù)出膏率公式計(jì)算出膏率。

2.2 原飲片與煮散飲片均一性比較

分別取3個(gè)批次市售飲片各200 g，充分混合后，粉碎均勻，過(guò)篩，得到10-65目粒徑范圍的煮散飲片，取其中300 g，均勻攤平，畫(huà)格分為9份，隨機(jī)選取3份（S1-S3），從每份中分別稱取20 g；另分別取同批次原飲片各取20 g（S4：160404531，S5：160900951，S6：160202），上述6份樣品按2.1項(xiàng)下方法煎煮。合并煎煮液，濃縮成100 mL溶液，即濃縮為0.2 g·mL-1的原藥材溶液。原飲片及煮散飲片形態(tài)見(jiàn)圖1。

2.3 高效液相測(cè)定方法

2.3.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱取淫羊藿苷對(duì)照品適量，加入甲醇配制成每1 mL含0.1 mg淫羊藿苷的對(duì)照品溶液，過(guò)0.22 μL微孔濾膜，備用。

2.3.2 樣品溶液制備

取上述飲片提取濃縮液2.5-10.0 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，即得供試品溶液，進(jìn)樣前用0.22 μm濾膜過(guò)濾。

2.3.3 含量測(cè)定方法

采用高效液相方法測(cè)定，色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）。檢測(cè)方法按照《中國(guó)藥典》2015年版一部淫羊藿含量測(cè)定項(xiàng)下淫羊藿苷測(cè)定方法。

2.3.4 指紋圖譜測(cè)定方法

采用高效液相方法測(cè)定，流動(dòng)相由乙腈（A）和水（B）組成，洗脫梯度如下表；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，流速為1 mL·min-1，進(jìn)樣量為20 μL（表1）。

2.4 DNA條形碼檢測(cè)方法

選取各批次及混合后煮散飲片樣本各約40 mg，用組織研磨儀磨碎，采用植物DNA提取試劑盒提取基因組總DNA。PCR擴(kuò)增步驟與文獻(xiàn)一致，分別擴(kuò)增ITS2及psbA-trnH序列[5]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，將電泳條帶清晰、明亮、單一的PCR產(chǎn)物送測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序。序列校對(duì)拼接采用CodonCode Alinger 6.02，去除低質(zhì)量區(qū)并采用基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8S和28S區(qū)段，獲得完整的ITS2序列。利用軟件MEGA 6.06分析比對(duì)，分析ITS2序列特點(diǎn)。

3 結(jié)果

3.1 不同規(guī)格飲片出膏率考察

不同規(guī)格煮散飲片與市售原飲片的煎煮出膏率結(jié)果如表2所示，與原飲片比較，粉碎后不同粒徑煮散飲片的出膏率均有一定程度增加；但不同規(guī)格煮散飲片之間的出膏率差異不明顯。在煎煮過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，如果飲片粉碎過(guò)細(xì)（小于65目），容易在煎煮過(guò)程中產(chǎn)生糊化現(xiàn)象。

表1 指紋圖譜測(cè)流動(dòng)相洗脫梯度

表2 市售原飲片與不同粉碎度精準(zhǔn)煮散飲片的出膏率（±s，n=3）

表2 市售原飲片與不同粉碎度精準(zhǔn)煮散飲片的出膏率（±s，n=3）

飲片規(guī)格出膏率/%澄清度原飲片11.96±0.14 ++++ 5-10目（2-4 mm）14.85±0.52 +++ 10-24目（0.8-2.0 mm）13.02±1.76 +++ 24-65目（0.25-0.80 mm）16.46±0.18 ++

圖2 淫羊藿苷對(duì)照品HPLC-DAD色譜圖

圖3 淫羊藿飲片HPLC-DAD色譜圖

3.2 飲片指標(biāo)成分含量均一度評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)以淫羊藿主要指標(biāo)成淫羊藿苷（藥典含測(cè)指標(biāo)）為檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)3批淫羊藿飲片及其經(jīng)混勻粉碎后的煮散飲片進(jìn)行均一性比較，對(duì)照品及樣品溶液HPLC-DAD色譜圖分別見(jiàn)圖2、圖3。

表3 淫羊藿飲片綠原酸煎煮提取率結(jié)果

表4 淫羊藿270 nm指紋圖譜相似度結(jié)果

采用《中國(guó)藥典》含量測(cè)定方法，對(duì)6份淫羊藿樣品進(jìn)行測(cè)定，各飲片的淫羊藿苷含量測(cè)定結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，淫羊藿3批市售飲片經(jīng)均一化處理后，指標(biāo)性成分淫羊藿苷含量的RSD值顯著下降，說(shuō)明3批樣品經(jīng)粉碎處理后均一度得到明顯提高。

3.3 指紋圖譜研究

3.3.1 指紋圖譜及相似度評(píng)價(jià)

取上述藥材，按指紋圖譜檢測(cè)方法檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm的淫羊藿煎煮液主要色譜峰指紋圖譜如圖4所示。采用國(guó)家藥典委員會(huì)2014年版指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件，比較市售原飲片與煮散飲片指紋圖譜相似度，見(jiàn)表4。結(jié)果顯示在現(xiàn)有的檢測(cè)方法下，市售飲片與經(jīng)粉碎混勻得淫羊藿煮散飲片共6批樣品的主要色譜峰均可以良好的匹配，相似度分析結(jié)果顯示粉碎后樣品（S1-S3）的相似度均在0.90以上，而3批原飲片由于產(chǎn)地來(lái)源等因素影響，產(chǎn)于江蘇的樣品S6其相似度為0.85，另外2批相似度可達(dá)0.90以上。通過(guò)指紋圖譜分析結(jié)果表明，樣品經(jīng)粉碎后其液相指紋圖譜未發(fā)生明顯改變，采用指紋圖譜相識(shí)度分析方法可以用于淫羊藿煮散飲片的真?zhèn)舞b別。同時(shí)，不同批次樣品經(jīng)粉碎后，其相似度得到提高，進(jìn)一步說(shuō)明淫羊藿煮散飲片經(jīng)粉碎后其均一性得到提高。

圖4 市售原飲片及混合后精準(zhǔn)煮散飲片HPLC指紋圖譜

3.3.2 共有峰相對(duì)峰面積比較

實(shí)驗(yàn)還比較了市售飲片與煮散飲片8個(gè)共有峰相對(duì)峰面積，如表5所示，結(jié)果表明經(jīng)粉碎處理的淫羊藿煮散飲片（S1-S3）在共有峰的個(gè)數(shù)及峰面積方面，其均一性均比3批原飲片較高，進(jìn)一步說(shuō)明了樣品經(jīng)粉碎后均一性得到提高。

3.4 DNA條形碼序列分析

應(yīng)用MEGA6.06分析淫羊藿3條ITS2序列特征，發(fā)現(xiàn)種內(nèi)無(wú)變異位點(diǎn)，3條淫羊藿序列長(zhǎng)度均為247 bp，A、C、G、T的堿基含量分別為17.81%、28.74%、26.32%、27.13%，GC含量達(dá)55.06%。3條psbA-trnH序列比對(duì)后長(zhǎng)度為499 bp，存在1個(gè)變異位點(diǎn)，為207位點(diǎn)G/T突變。經(jīng)中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)鑒定為朝鮮淫羊藿Epimedium koreanum。主導(dǎo)單倍型序列特征見(jiàn)圖4、圖5。

4 討論

本文收集了3批次淫羊藿市售飲片，飲片均勻混合粉碎后制成煮散飲片，采用HPLC-DAD含量測(cè)定法、指紋圖譜分析法以及DNA序列比對(duì)研究等研究方法，比較淫羊藿煮散飲片與市售飲片質(zhì)量差異。研究結(jié)果表明，原飲片與精準(zhǔn)煮散因在成分的種類上未有明顯改變，具有屬性的一致性，但粉碎混勻后的精準(zhǔn)煮散飲片指紋圖譜相似度更好，其浸出率及質(zhì)量均一性有所提高。

表5 共有峰峰面積比較

圖5 淫羊藿ITS2序列

圖6 淫羊藿psbA-trnH序列

淫羊藿為葉類飲片，質(zhì)脆易碎，較輕薄、疏松，并含有部分木質(zhì)纖維，破碎時(shí)易出現(xiàn)少量纖維與細(xì)顆粒分離，一定程度上影響飲片的質(zhì)量均一性，所以淫羊藿破碎推薦采用剪切式粉碎儀，將淫羊藿藥材切割成大小較均一的片狀細(xì)微顆粒。精準(zhǔn)煮散飲片僅是改變了中藥飲片的形狀規(guī)格，使其微小均勻化，與傳統(tǒng)中藥煮散并無(wú)不同，但其內(nèi)涵超越了傳統(tǒng)中藥煮散，可實(shí)現(xiàn)飲片質(zhì)量均一化，飲片分裝、調(diào)劑、煎煮自動(dòng)化，使中藥劑量和湯劑質(zhì)量更加精準(zhǔn)，并能提高中藥資源的合理利用。此外，葉類藥材品種之間整體狀的表現(xiàn)差異較小，極易混淆，影響用藥安全。中藥DNA條形碼鑒定體系與中藥指紋圖譜技術(shù)的發(fā)展，解決了葉類藥材及傳統(tǒng)煮散的“辨藥之難”問(wèn)題，能有效實(shí)現(xiàn)煮散飲片的精準(zhǔn)化鑒定和檢測(cè)，為精準(zhǔn)煮散飲片的應(yīng)用與推廣提供可靠的技術(shù)支持與保障。

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A Quality Research on the Precise Powder Decoction Pieces of Medicinal Leafage Epimedii Folium

Zhang Jing1, Xu Wen1, Gong Lu1, Li Xiwen2, Xiao Shuiming2, Xu Jiang2, Qiu Xiaohui1, Huang Zhihai1
(1. The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine / Guangdong Provincial Academy of Chinese Medical Sciences / China Academy of Chinese Medical Sciences Guangdong Branch, Guangzhou 510006, China; 2. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)

This study aimed at evaluating the quality of precise powder decoction pieces (PPDP) ofE. Folium(EF) compared with the traditional commercial slices by chemical fingerprint methods and DNA molecular identification technology. Different specifications of PPDP were prepared， and their dry extract contents were incontrast with that of commercial slices. The slices of EF were identified using ITS2 and psbA-trnH sequences. Three batches of commercial slices were collected， and the content uniformity， fingerprint and similarity evaluation before and after the mixing and pulverization were detected by HPLC-DAD and DNA sequence alignment. It was found that the paste rate of PPDP was slightly higher than that of the traditional commercial slices. The dissolution of chlorogenic acid of PPDP was higher than that of the traditional commercial slices. RSD of inter-assay dissolutions of chlorogenic acid of commercial slices was 15.56%， which was reduced to 6.82% after mixing and preparing into PPDP. The fingerprints showed that the similarity of the PPDP of EF was elevated with the inceases of 10 marketed common peaks. The PPDP of EF was accurately identified by ITS2 and psbA-trnH sequences. In conclusion， compared with traditional commercial slices of EF， the PPDP apparently improved the dissolution rate and the quality uniformity， demonstrated that the boiled powder of CRP achieved obvious clinic advantages.

Epimedii Folium， precise powder decoction pieces， DNA barcode， fingerprint

10.11842/wst.2017.01.015

R28

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-12-23

修回日期：2017-01-04

＊ 廣東省中醫(yī)院院內(nèi)專項(xiàng)（2015KT1817）：嶺南中草藥DNA條形碼分子鑒定和生態(tài)適應(yīng)性研究，負(fù)責(zé)人：黃志海；中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥健康服務(wù)發(fā)展專項(xiàng)（ZZ0908067）：200余種嶺南中草藥DNA條形碼研究，負(fù)責(zé)人：黃志海。

＊＊ 通訊作者：丘小惠，研究員，主要研究方向：中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究；黃志海，主任藥師，主要研究方向：中藥資源與中藥鑒定研究。