靶向番茄SlACS2基因CRISPR-Cas9 sgRNA的設計和分析

白云鳳，張愛萍，閆建俊，賀飛燕，張維鋒*,馮瑞云，劉江娜，張西英

(1.農業部黃土高原作物基因資源與種質創制重點實驗室,作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室(山西省農業科學院作物科學研究所)，太原 030031；2. 新疆生產建設兵團第6師農業科學研究所，新疆 五家渠831300；3.山西大學生物工程學院，太原030006)

靶向番茄SlACS2基因CRISPR-Cas9 sgRNA的設計和分析

白云鳳1，張愛萍2，閆建俊1，賀飛燕3，張維鋒1*,馮瑞云1，劉江娜2，張西英2

(1.農業部黃土高原作物基因資源與種質創制重點實驗室,作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室(山西省農業科學院作物科學研究所)，太原 030031；2. 新疆生產建設兵團第6師農業科學研究所，新疆 五家渠831300；3.山西大學生物工程學院，太原030006)

番茄為呼吸躍變型果實，伴隨呼吸躍變產生大量乙烯，即系統II乙烯，易使番茄果實過熟，導致腐爛變質。SlACS2是番茄系統II乙烯合成的限速酶，通過CRISPR-Cas9基因組編輯系統修飾該基因，調控系統II乙烯過量表達，將遲滯番茄過熟。本研究基于RNA-seq建立了SlACS2基因的數字表達譜，表明該基因呈果實特異性表達，在植株的根、莖、葉等部位不表達。SlACS2位于番茄1號染色體，含4個外顯子和3個內含子。利用在線工具CRISPRdirect 和CRISPR-P發現第1、2、3外顯子分別具有18、9和11條sgRNA。其中，sgRNA1-14和sgRNA3-8及二者的近PAM的12 nt 種子序列在番茄基因組是唯一序列，GC含量高于40%，不存在TTTT終止序列。BLAST結果表明，sgRNA1-14和sgRNA3-8與GenBank公布的8條SlACS2同源序列高度一致，位于該基因的保守區，而與SlACS4和SlACS6的同源序列存在多個SNP，預示這2條sgRNA可用于番茄不同品種SlACS2基因的靶向編輯，并可規避對SlACS家族其他同源基因的脫靶效應。

番茄；ACC合成酶2；sgRNA；CRISPR-Cas9；基因組編輯

FENG Ruiyun1, LIU Jiangna2, ZHANG Xiying2

乙烯(Ethylene)是植物內源激素，對植物生長發育具有重要調控作用。具有呼吸躍變的果實在呼吸躍變前產生基礎水平的少量乙烯，被稱為系統I乙烯，調控植物正常生長、發育和應對脅迫反應等。系統I乙烯具有自抑制機制。隨著果實成熟，伴隨呼吸躍變產生大量乙烯，被稱為系統II乙烯。系統II乙烯具有自催化機制，促進花的凋亡和果實成熟[1]。

乙烯的生物合成遵循甲硫氨酸(Methionine，Met)→S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosyl methionine，SAM)→1-氨基環丙烷1-羧酸ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC)→乙烯的途徑。ACC是合成乙烯的直接前體，由ACC合成酶ACS(ACC synthase)催化SAM形成，這個過程被認為是乙烯合成的限速步驟，ACS是乙烯合成的限速酶。番茄(Solanumlycopersicum)是呼吸躍變型果實，其ACS(SlACS)由多基因家族編碼，SlACS1A和SlACS6主導系統I乙烯的合成，負責番茄果實在呼吸躍變前產生基礎水平的少量乙烯，SlACS2和SlACS4主導系統Ⅱ乙烯的合成[2]，在果實成熟過程中伴隨呼吸躍變產生大量乙烯，使得番茄成熟過程難以控制，果實易過熟導致腐爛變質。

通過基因工程手段抑制番茄SlACS2的表達，主要是把SlACS2的反義RNA基因[3-4]或RNAi基因[5-6]導入番茄，可以減緩番茄果實中的乙烯合成，遲滯果實過熟，延長貨架期，提高耐貯運性能。上述利用常規轉基因技術，導入的外源基因在植物基因組上的整合位置具有隨機性，容易出現一些非預期效應，如轉基因整合到宿主基因的“閱讀框”，使其不能有效表達，影響基因工程育種效率。民眾對于轉基因的安全性疑慮，也增加了轉基因作物評價和應用成本。

CRISPR-Cas9是一種新型的基因組定點編輯系統[7-8]，其通過一段20 nt的sgRNA(Single guide RNA)與基因組同源序列互補配對引導Cas9蛋白結合于基因組的特異性位點，在sgRNA 3’端PAM(Protospacer adjacent motif， 前間區序列鄰近基序)元件上游的第3～4 bp處剪切，造成DNA雙鏈斷裂(Doubled-strand breaks, DSB)。不同CRISPR-Cas9的PAM序列有所不同，經典釀膿鏈球菌(Streptpcpccuspyogenes)中的PAM元件序列為5’-NGG-3’。因此，CRISPR-Cas9系統中靶位點的選擇是由20 nt 的sgRNA及3’端的PAM序列共同決定的。

Cas9蛋白切割造成的DNA雙鏈斷裂有兩條修復途徑[9]，即非同源末端連接(Non-homologous end joining, NHEJ)和同源重組(Homologous recombination, HR)。非同源末端連接是主要修復途徑，同源重組只發生在特定的細胞周期和類型中。非同源末端連接容易出錯，修復過程中會引入短的缺失或插入，抑制或修飾特定基因功能。與誘發突變相比，CRISPR-Cas9系統為定點突變，效率高、可控性好。CRISPR-Cas9系統通過植物基因組原位編輯來抑制或修飾基因功能，無需整合新基因，比轉基因技術更為安全可控，易于消除民眾安全性疑慮。

CRISPR-Cas9系統中，20 nt的sgRNA及其3’端的PAM元件總長度僅23 nt，易在基因組的非目標區段出現同源序列。另外，Cas9核酸酶可能切割與sgRNA不完全匹配的序列，導致脫靶效應[10-11]。規避脫靶效應和提高編輯效率是應用CRISPR-Cas9系統的關鍵。本文設計、篩選出了番茄SlACS2基因的sgRNA，以期為利用CRISPR-Cas9技術抑制SlACS2基因表達、提高番茄的耐貯運性能提供依據。

1 材料與方法

1.1SIACS2數字表達譜的建立

以番茄功能基因組數據庫網站(http://ted.bti.cornell.edu/cgi-bin/)中RNA-seq data的數據作基礎，建立SlACS2基因的基于RNA-seq的數字表達譜。

1.2SlACS2染色體定位和基因組結構的確定

利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)核酸數據庫查詢獲得SlACS2的cDNA，以此作query，搜索番茄基因組數據庫得到相應的gDNA序列和所在染色體信息。通過序列比對確定SlACS2的基因組結構以及外顯子所在染色體位置。

1.3 sgRNA的設計和選擇

根據CRISPR-Cas9靶點設計原則，利用CRISPRdirect((https://crispr.dbcls.jp/)[12], 2015) 篩選SlACS2外顯子區域的sgRNA序列，即3’端有PAM元件的20個連續的堿基序列，PAM元件設定為NGG[13]，sgRNA的結構為5’-(N)20NGG-3’，N為任意核苷酸。利用CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/)[14]對sgRNA的靶向特異性進行綜合評分。

2 結果與分析

2.1基于RNA-seq的SlACS2數字表達譜分析

以番茄功能基因組RNA-seq數據庫為基礎，分析了SlACS2基因(TC125329) 在不同組織以及不同生長時期的的表達模式(見圖1)。結果顯示，SlACS2在番茄的種子、胚根、頂端分生組織、不同時期的幼苗、根系、葉片、花蕾、綠果中均無表達，在子房和愈傷組織中有低水平表達，在破色期的果實和成熟的紅果實中有較高水平的表達。上述基于RNA-seq的表達譜分析證實了SlACS2是與果實成熟相關的基因，利用CRISPR-Cas9技術對該基因進行原位編輯，有可能減緩番茄內源乙烯的產生，遲滯番茄過熟，提高貯運品質。

2.2SlACS2染色體定位和基因組結構

從GenBank 搜索到SlACS2序列(GenBank Accession：NM_001247249.2)，mRNA長度1 855 nt， cds位于181～1 629 nt之間，長度1 458 nt。

以SlACS2的cds作Querry，在番茄的基因組數據庫進行Blast。比對結果表明，SlACS的gDNA位于番茄的1號染色體(GenBank Accession：NC_015438.2)，位置在88 456 011～88 453 490 nt之間，長度2 522 nt，由4個外顯子、3個內含子組成(見圖2)，前3個外顯子均較短，位于SlACS2的5’端，可在每個外顯子區域設計sgRNA，規避sgRNA分布在外顯子和內含子連接處。

圖1 基于RNA-seq的SlACS2表達譜Fig.1 The digital expression profile of SlACS2 based on RNA-sequence

注：1-子房; 2-半綠果實; 3-成熟綠果實; 4-破色期果實; 5-成熟紅果實; 6-花蕾(0-3 mm); 7-花蕾(3-8 mm); 8-開花前花蕾(8 mm); 9-完全展開花; 10-發育階段花的混合物; 11-野生番茄花粉; 12-感染假單胞菌葉片; 13-假單胞菌葉片; 14-混合誘導葉片; 15-植株的頂端分生組織(4-6周齡); 16-植株頂端分生組織(8周齡); 17-花前根; 18-掛果期根; 19-營養匱乏的根; 20-完全吸漲5 d后的胚根; 21-完全吸漲7 d后的幼苗; 22-休眠種子; 23-愈傷組織。

PRKM: 每百萬reads中來自于特定基因每千堿基長度的reads數。

圖2 SlACS2的基因組結構和染色體位置Fig.2 SlACS2 enomic costructure and its location on the chromosome

2.3SlACS2第1外顯子sgRNA的設計和評價

SlACS2第1外顯子長度171 nt，位于染色體88 456 011～88 455 841 nt之間。根據CRISPR-Cas9靶點設計原則，設定sgRNA長度為20 nt，下游的PAM元件為NGG。CRISPRdirect在線工具分析表明，第1外顯子含有18條sgRNA(見表1)。CRISPR-P分析表明，這些sgRNA的靶向特異性綜合得分在29～49。

在CRISPR-Cas9系統中，sgRNA的轉錄通常由U6或者U3啟動子驅動，二者驅動轉錄的活性相對較高。U6或者U3啟動子屬于Pol III型啟動子[15]，連續的TTTT序列會使轉錄終止。在第1外顯子的18條sgRNA中，有9條(sgRNA1-1、-4、-5、-6、-8、-9、-11、-12、-18)含有連續的TTTT序列，可排除選擇。另外， sgRNA1-2的GC含量較低， sgRNA1-7除了在靶位點外，在番茄5號染色體上也有與之完全匹配的序列，易產生脫靶效應。在其余7條sgRNA(見圖3)中，位于外顯子132～154 nt的sgRNA1-14特異性最好，該sgRNA和它包含的對特異性起重要作用的、鄰近PAM 的12 nt種子序列[16]在番茄基因組上均是唯一序列，其他部位沒有與之完全匹配的序列。sgRNA1-14的GC含量45%，靶向特異性綜合得分也最高，可作為優選sgRNA。

注：字體加粗表示該sgRNA具有高特異性；含有連續TTTT的靶向序列用灰色表示，含有polIII啟動子的載體應避免sgRNA中含連續的TTTT序列。

圖3 SlACS2第1外顯子主要sgRNAs的分布。Fig.3 The position of some important sgRNAS of exon 1 in SlACS2

注：括號內數值為該sgRNA所在外顯子位置。

Cas9蛋白包含氨基端的RuvC-like結構域及位于蛋白中間位置的HNH核酸酶結構域。HNH核酸酶結構域切割與sgRNA互補配對的模板鏈，RuvC-like結構域切割另1條鏈。突變Cas9核酸酶的一個功能結構域時，則只能切割DNA雙鏈中的一條鏈，形成Cas9單切口酶(Nickase)。體內DNA單鏈斷裂修復采用堿基切除修復途徑，不能產生突變。當1對分別位于染色體正負鏈上、方向相反且距離較近的兩個sgRNA(即“Paired-sgRNA”)同時引導Cas9單切口酶對基因組編輯時，兩個近距離的單鏈斷裂會組成雙鏈斷裂，通過非同源末端連接修復，造成短的缺失或插入，導致移碼突變；而潛在的脫靶位點處只有單鏈斷裂，修復過程不易發生突變。因此，采用“paired-sgRNA”和Cas9單切口酶編輯策略時，酶切識別所涉及的核苷酸數就由20 nt增加到40 nt，從而提高靶位點的專一性，降低脫靶風險[17-18]。據此，采用“paired-sgRNA”和Cas9單切口酶編輯策略，對第1外顯子sgRNA1-3及其互補鏈的sgRNA1-14進行切割，間隔66 nt，有較大概率產生專一性移碼突變。

2.4SlACS2第2、3外顯子sgRNA的設計和分析

SlACS2第2外顯子位于染色體86 455 742～86 455 614 nt之間，長129 nt，與第1外顯子相隔98 nt的內含子。CRISPRdirect在線分析表明，第2外顯子有9條sgRNA序列，其GC含量均低于35%，鄰近PAM 12 nt 的種子序列的脫靶位點在2個以上(見表2)，沒有合適的sgRNA可供選擇。

表2 SlCAS2基因第2外顯子含有sgRNAsTable 2 sgRNAs of exon 2 in SlCAS2 gene

SlACS2第3外顯子位于染色體86 455 528～86 455 368 nt之間，長161 nt，與第2外顯子相隔85 nt的內含子，與第4外顯子相隔881 nt的內含子。CRISPRdirect在線分析表明，第3外顯子有11條sgRNAs。CRISPR-P分析表明，sgRNAs的靶向特異性綜合得分在22～48，差異較大(見表3)。在這些sgRNAs中，sgRNA3-9和sgRNA3-10含有連續的TTTT序列，易使轉錄提前終止；sgRNA3-1、-2、-3的GC含量較低；sgRNA3-6的靶向特異性綜合得分最低。在其余5條sgRNAs(見圖4)中，sgRNA3-8特異性最好，其鄰近PAM 12 nt 的種子序列在番茄全基因組上是唯一序列，其他部位沒有與之完全匹配的序列，靶向特異性綜合得分也較高。該sgRNA 3’端第20位的堿基為鳥嘌呤G，意味著基因組編輯效率較高[19]，可作為優選序列。sgRNA3-11特異性也較好，靶向特異性綜合得分也較高，其12 nt 的種子序列除了靶位點外，在5號染色體的1個位點上有與其完全匹配的序列，其脫靶效應可根據脫靶位點兩側的序列(見圖5)設計引物，對PCR產物測序予以驗證。另外該sgRNA的第一堿基為G，也適合U6啟動子轉錄，是另一優選序列。sgRNA3-8與位于互補鏈的sgRNA3-4間隔5 nt，sgRNA3-11與位于互補鏈的sgRNA3-7之間相隔34 nt，這兩對sgRNA均可設計為“paired-sgRNA”，用Cas9單切口酶進行編輯。

2.5 優選sgRNA的SNP分析

以SlACS2的第1和第3外顯子作Query在GenBank中進行BLAST，搜索同源序列，進行多序列比對(見圖6, 圖7)。比對結果表明， sgRNA1-14、sgRNA3-11在搜索到的8條序列上均完全一致，sgRNA3-8也只有1個SNP，表明本研究優選的3條sgRNA均具有較好的保守性，可用于不同品種SlACS2基因的靶向編輯。而與GenBank公布的SlACS4和SlACS6比對，sgRNA1-14均有5個SNP，其中3個位于種子序列區；sgRNA3-8分別有3個和6個SNP，且有1個SNP位于PAM的第2個核苷酸，TGG突變為TAG；sgRNA3-11有3個SNP，其中2個位于種子序列區；預示本研究優選的3條sgRNA均可規避對SlACS家族其他成員的脫靶效應。

注：字體加粗示該sgRNA具有高特異性；含有連續TTTT的靶向序列用灰色表示，含有polIII啟動子的載體應避免sgRNA中含連續的TTTT序列。

圖4 SlACS2第3外顯子主要sgRNAs的分布Fig.4 The position of some important sgRNAS of exon 3 in SlACS 2

注：括號內數值為該sgRNA所在外顯子位置。

圖5 第3外顯子sgRNA3-11的脫靶位點和染色體位置Fig.5 The position of off-target site of sgRNA3-11 in exon 3

圖6 SlACS2第1外顯子sgRNA1-14的SNP位點Fig.6 SNP loci on sgRNA1-14 of exon 1 in SlACS2

3 討論

科學設計sgRNA，提高基因組編輯效率和最大限度降低脫靶風險是CRISPR/Cas9 系統面臨的最大挑戰。番茄是模式植物之一，已完成了全基因組測序，sgRNA的特異性及其脫靶位點可通過全基因組層面掃描獲得相關信息。sgRNA的設計已有多個工具軟件和在線分析平臺，如CRISPRdirect綜合考慮了sgRNA全長和12 nt及8 nt種子序列的特異性，結果輸出中會標出每條sgRNA在外顯子上的位置和GC含量，還將特異性高、脫靶位點少的sgRNA以及含有轉錄終止序列“TTTT”的 sgRNA 分別用亮綠色和灰色作出標示；華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室開發的CRISPR-P則根據特定公式對每個sgRNA序列的靶向特異性進行綜合評分和排序，并標示出sgRNA靶標位點中是否含限制性內切酶識別序列，以方便采用酶切法檢測基因組切割效率。本研究綜合運用CRISPRdirect和CRISPR-P兩個在線分析平臺，對SlACS2基因5’端的第1、2、3個外顯子上所分布的sgRNAs進行了綜合評價，篩選出3條sgRNAs優選序列，即第1外顯子sgRNA1-14、第3外顯子sgRNA3-8和sgRNA3-11。其中sgRNA1-14和sgRNA3-8的全序列或12 nt的種子序列在番茄基因組上均為唯一序列，但它們的5’端第1個堿基為A或C。雙子葉植物sgRNA 的轉錄一般選用U6啟動子驅動，其轉錄活性相對較高，有明確的轉錄起始位點，即以“G”堿基開頭。精確起始轉錄能消除無關 DNA 序列的轉錄，從而減少脫靶效應的產生[20-21]。因此，如果選用U6啟動子，需要在這2條sgRNA的5’端添加鳥嘌呤核苷酸。有研究表明，在sgRNA的5’端額外增加兩個鳥嘌呤核苷酸后能夠顯著提高CRISPR/Cas9 系統的特異性[17]，為非G起始的sgRNA應用提供了依據。

乙烯除了促進果實成熟，在植物種子萌發、葉片擴展、根毛伸長、側根生長、開花、植株衰老等階段均起重要作用。抑制番茄系統I或過度抑制系統II乙烯的生成，將影響番茄的正常生長或致使果實不能成熟。本研究從SlACS2中篩選出的3條sgRNAs與GenBank中公布的SlACS4和SlACS6的同源序列存在3～8個SNP，其中2～3個SNP分布在12 nt的種子序列區。這些SNP的存在規避了sgRNA對SlACS4和SlACS6的脫靶效應，可望達到預期目的：(1)既抑制系統II乙烯合成限速酶基因SlACS2的表達，又不影響SlACS4的正常表達，使系統II乙烯保持在一定水平而不致過量，以遲滯番茄過熟；(2)不干擾系統I乙烯形成的SlACS6基因的正常表達，保證番茄的正常生長。生物信息學可以提供許多有用信息，但不能代替實驗驗證。在應用這3條優選的sgRNA改良番茄的耐貯運性狀前，可先用原生質體系統驗證其靶向能力和編輯效率。

CRISPR-Cas9系統通過sgRNA引導Cas9蛋白在PAM元件上游第3～4 bp處剪切，造成DNA雙鏈斷裂，在非同源末端連接修復過程中引入短的缺失或插入，使基因失活，但失活基因仍能復制和轉錄，消耗植物營養和能量，如能刪除失活基因的完整序列或大片斷，將降低植物營養和能量的消耗。近年來，已通過雙sgRNA引導Cas9系統在植物[22-23]和動物[24]上刪除了一段DNA序列，最大缺失片段達105 kb。本研究篩選的sgRNA1-14和sgRNA3-8特異性較好，在染色體上相隔409 nt，利用雙sgRNA引導Cas9將其刪除，造成DNA大片段缺失，將更徹底的抑制SlACS2基因功能。

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Design and evaluation for sgRNAs targetingSlACS2 gene in CRISPR/Cas9 system

BAI Yunfeng1, ZHANG Aiping2, YAN Jianjun1, HE Feiyan3, ZHANG Weifeng1*,

(1.KeyLaboratoryofCropGeneResourcesandGermplasmEhhancementonLoessPlateau,MinistryofAgriculture,ShanxiProvinceKeyLaboratoryofCropGeneticsandMolecularImprovement(InstituteofCropScience,ShanxiAcademyofAgriculturalSciences),Taiyuan030031,China;2.InstituteofAgriculturalScience,SixthDivision,XinjiangProductionandConstructionCorps,Wujiaqu831300,China;3.CollegeofBioengineering,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China)

Tomatoes are typical climacteric fruits and produce large amounts of ethylene, i.e. system II ethylene with the climacteric, which makes the tomato fruits overripe and Perishable. ACC synthase 2 in tomato (SlACS2) is the key enzymy during the process of biosynthesis of the system II ethylene. Suppressing the expression of the system II ethylene will postone the fruits overripen by using CRISPR-Cas9 genome editing system to modify theSlACS2 gene. In this study the digital expression profile ofSlACS2 based on RNA-seq shows thatSlACS2 gene is expressed specifically in fruit.SlACS2 gene is located in chromosome 1 of tomato, containing four exons and three introns. In the first, second and third exon, 18, 9 and 11 sgRNAs are found by using related online tools CRISPRdirect and CRISPR-P respectively. sgRNA1-14 and sgRNA3-8, and their 12nt seed sequences proximal the protspacer adjacent motif (PAM) all are unique and no completely homologous sequences in other location of tomato genome is found. The GC content is higher than 40% and there is no termination sequence TTTT in sgRNA1-14 and sgRNA3-8. The BLAST results show that sgRNA1-14 or sgRNA3-8 is highly consistent with the sequences of the homologous sites of eightSlACS2 homologous genes, suggesting that the two sgRNAs are located in the conserved regions ofSlACS2 gene. Multiple single nucleotide polymorphisms (SNPs) are found between sgRNA1-14 or sgRNA3-8 or their respective seed sequence and the sequences of the homologous sites ofSlACS6 orSlACS4, indicating that the two sgRNAs can be used to edit theSlACS2 gene in different varieties with minimal off-target effects for other members inSlACSfamily.

Tomato; ACC synthase 2; sgRNA; CRISPR-Cas9; Genomic editing

2016-09-03；

2016-10-18.

國家自然科學基金項目(No.30971838)；山西省應用基礎研究項目(No.201601D011075)。

白云鳳，女，博士，研究員，研究方向：植物分子遺傳研究；E-mail: byfok@126.com； 張愛萍，女，研究員，研究方向：園藝植物育種；E-mail: 379409419@qq.com.

*通信作者：張維鋒，男，研究員，研究方向：植物遺傳育種研究；E-mail: zhwfen@sina.com.

10.3969/j.issn.1672-5565.2017.01.201609002.

Q986;S641.2

A

1672-5565(2017)01-007-09