重組瓊膠酶rAgaN3基因的生物信息學分析

謝 勇，洪曉昆，鄢仁祥，林 娟

(福建省海洋酶工程重點實驗室(福州大學),福州 350116)

重組瓊膠酶rAgaN3基因的生物信息學分析

謝 勇，洪曉昆，鄢仁祥，林 娟

(福建省海洋酶工程重點實驗室(福州大學),福州 350116)

利用生物信息學軟件和數據庫對從Microbulbifersp. BN中得到的瓊膠酶rAgaN3全長基因進行預測分析，結果表明：重組瓊膠酶rAgaN3理論分子量為31.243 kDa，理論等電為4.81，不穩定系數為26.23，脂肪系數為62.35，平均疏水性系數為-0.662，無跨膜結構域，無信號肽；二級結構表明該蛋白無螺旋結構，有15個折疊結構，其余均為卷曲結構；序列相似性分析表明，蛋白rAgaN3屬于糖苷水解酶GH16家族，為β-瓊膠酶；以同源蛋白3wz1A(同源性88%)為模板，通過同源建模構建出了蛋白三級結構，并用拉式圖進行了結構檢驗。瓊膠酶rAgaN3基因的生物信息學分析，為瓊膠酶的異源表達提供了指導，為瓊膠酶的定點突變、深入研究其結構和功能的關系打下良好基礎。

瓊膠酶；基因分析；生物信息學；蛋白結構

瓊脂存在于石花菜科和龍須菜科紅藻細胞壁中，主要由瓊脂糖和瓊脂膠組。其中瓊脂糖是由(1-3)-O-β-D-半乳糖和(1-4)-O-3,6-內醚-α-L-半乳糖交替組成的線形鏈狀分子[1]，是目前世界上應用最廣泛的海藻多糖之一。瓊膠具有膠凝性和凝膠的穩定性，因而在食品工業中常被用作膠凝劑、增稠劑、乳化劑、增量劑、助懸劑、水分保持劑、穩定劑、賦形劑等。

瓊膠酶是一種能夠降解瓊膠，產生瓊膠寡糖的酶總稱。根據瓊膠酶作用糖苷鍵的不同可以分為兩類：α-瓊膠酶和β-瓊膠酶[2-3]。目前已報道的瓊膠酶大多來源于海洋微生物，其中α-瓊膠酶主要來自假單胞菌屬、單胞菌屬和弧菌屬，β-瓊膠酶主要來源于弧菌屬、交替單胞菌屬[4]。在許多軟體動物的消化液的微生物中可以分離得到瓊膠酶，比如濱螺屬(Littorinastriata)、海兔屬(Aplysiadactylomela)、冠海詹屬(Diademaantillarum)、鮑屬(Haliotiscoccinea)[5-6]。瓊膠酶可用做海藻降解的工具酶，多用于多糖結構的研究[7]，瓊膠寡糖的制備以及在分子生物學方面也多有應用[8]。

目前關于瓊膠酶的研究主要集中在菌種選育和基因工程菌構建上，傳統菌株選育出的菌株所產瓊膠酶常存在酶活低、穩定性差等缺點，通過基因克隆表達重組瓊膠酶蛋白已經成為趨勢。從1987年Buttner等[9]首次實現瓊膠酶基因的異源表達開始，已經有一定數量的瓊膠酶基因被研究，但是國內對瓊膠酶基因的研究還不多。課題組從福建漳江口紅樹林泥樣中分離獲得一株產瓊膠酶菌株，并進行了形態學和16SrRNA鑒定，確定菌種為微球莖菌屬(Microbulbifersp.)，并通過TAIL-PCR方法克隆得到基因全長。目前報道的微球莖菌屬重組瓊膠酶還較少，且與此基因編碼的蛋白質序列有高同源性的蛋白3wz1A的結構已經得到解析[10]，為rAgaN3的后續研究提供了便利。本文利用生物信息學軟件和數據庫，預測其理化性質及結構信息，為瓊膠酶基因的異源表達和瓊膠酶結構與功能關系研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌株：Microbulbifersp. BN從福建漳江口紅樹林泥樣中分離獲得，利用 TAIL-PCR方法從中克隆得到瓊膠酶基因agaN3序列全長。

1.2 分析方法

(1)利用 NCBI的 blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和 MEGA5.2構建系統進化樹；

(2)利用 ProtParam[11](http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質的理化性質，包括相對分子質量、氨基酸組成、等電點、不穩定系數、總平均親水性等；

(3)利用ProtScale[11](http://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白質疏水性；

(4)利用TMHMM[12](http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析蛋白質跨膜區域；

(5)利用PSIPRED[12](http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)分子蛋白質二級結構，比如分螺旋、卷曲、無規則卷曲等；

(6)利用PredictProtein[13](https://www.predictprotein.org/)分析跨膜螺旋區域、二硫橋以及結合位點等性質；

(7)利用Signal P[14](http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析信號肽；

(8)利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)進行保守結構域搜索；

(9)利用SMART[15](http://smart.embl-heidelberg.de/)預測結構域；

(10)利用CAZY[16]數據庫(http://www.cazy.org/GH16.html/)查詢糖苷水解酶信息；

(11)利用TargetP 1.1[13](http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)分析亞細胞定位及導肽；

(12)利用 SWISS-MODEL[17](http://www.swissmodel.expasy.org/)進行同源建模；

(13)利用SAVES[18]服務器 (http://services.mbi.ucla.edu/SAVES/) 對蛋白結構殘基角度檢驗；

(14)利用PROSA[19]程序(https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php)對蛋白結構能量進行檢驗。

2 結果分析

2.1 基因序列分析

rAgaN3的 DNA序列共有 834 bp，其中第 831～834位為終止密碼子TAA，該蛋白含有 277個氨基酸。基因及蛋白序列如圖1。

從 NCBI的 BLASTp的序列比對結果中選擇12條Identity比較高的序列，與rAgaN3的序列在Clustal X 上進行序列比對，然后利用MEGA5.2構建系統進化樹。系統進化樹構建結果如圖2所示。

NCBI數據庫中BLASTp同源性分析表明，rAgaN3序列與已知瓊膠酶序列agaraseMicrobulbiferthermotolerans(BAD29947.1)、agaraseMicrobulbiferthermotolerans(3WZ1A)以及agaraseMicrobulbifersp. AG1(ALN70307.2)都有88%的序列相似性。

系統進化樹節點上的數字是自展值，用來分析進化樹分支可信度。0.05代表每100個氨基酸中5個氨基酸替換。由經過給定的repetitions(500次)重排構樹打分后，每個分支對應一個數值。數值越高，表示分支的可信度越高，由此來確定進化遠近程度。rAgaN3與Microbulbiferthermotolerans(3WZ1A)、Microbulbiferthermotolerans(BAD29947.1)的自展值均為 100。結合BLASTp同源性分析，基本可以確定該蛋白來自Microbulbiferthermotolerans。

2.2 蛋白質一級結構預測

2.2.1 蛋白質理化性質分析

通過ProtParam預測蛋白rAgaN3的理化性質，結果見表1。

圖 1 rAgaN3 基因序列和氨基酸序列Fig.1 rAgaN3 gene sequence and amino acid sequence

圖 2 系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree

2.2.2 親疏水性分析

蛋白質內部親疏水性氨基酸的組成影響蛋白質折疊的程度，蛋白質的折疊情況可利用親水性分布圖來反映。用ProtScale 計算出蛋白質親疏水性分布圖，用Hphob. / Kyte & Doolittle 標度，各個氨基酸打分分值見表2。

表 1 rAgaN3 理化性質分析表Table 1 Physical and chemical property analysis of rAgaN3

表 2 氨基酸分值表Table 2 Amino acid score

分析親水區和疏水區，如圖3所示。

圖 3 瓊膠酶氨基酸序列疏水性親水性預測Fig.3 Predicted hydrophobicity/hydrophilicity of the amino acid sequence of agarase

橫坐標表示氨基酸位置，縱坐標表示標度得分，Score小于0表示親水，大于0表示疏水。圖中顯示親水性值峰明顯多于疏水性值峰，這些親水性值峰區域常富集富集親水性氨基酸，同時也是蛋白質進化中氨基酸插入的主要位點[20]，推測此蛋白為親水性蛋白，蛋白可溶于水。

2.2.3 跨膜區預結構預測與信號肽分析

蛋白質的跨膜區域是指蛋白在膜內與細胞膜膜脂相結合的部分，TMHMM是一種基于隱馬爾可夫模型的跨膜螺旋預測算法，TMHMM的預測結果如圖4所示。

圖 4 瓊膠酶跨膜區預測Fig.4 Predicted transmembrane domain of agarase

TMHMM預測rAgaN3跨膜螺旋區域為零，說明該蛋白不是跨膜蛋白，推測該蛋白在細胞內合成之后不能立即分泌到胞外行使功能。

信號肽是將細胞內新合成的蛋白質引導分泌至胞外的短肽鏈，一般長度為5～30個氨基酸。SignalP是基于神經網絡網絡算法，預測給定氨基酸序列中潛在的信號肽剪切位點[14]。SignalP 4.1預測信號肽位置，結果如圖5。

圖 5 信號肽預測Fig.5 Signal P prediction of agarase

圖中C-score是信號肽酶切位點值，一般剪切位點處的C-score最高；S-score是信號肽值，一般信號肽區域的S-score最高；Y-score是綜合得出的剪切位點分值。預測結果顯示mean S score為0.052，遠小于分泌型蛋白標準0.5，結合圖13，可以認為此蛋白沒有信號肽。綜合跨膜區域和信號肽預測，蛋白rAgN3為胞內蛋白，需要在菌體裂解之后才能在胞外行使其功能。

2.3 蛋白質二級結構預測

蛋白質二級結構包括螺旋(Helix)、折疊(Strand)、無規則卷曲(Coils)以及模體(motif)等組件。

2.3.1 PSIPRED預測蛋白二級結構

PSIPRED通過PSI-BLAST 搜索同源序列預測蛋白質二級結構，由于采用嚴格的交叉驗證，使預測平均準確率高達80%。PSIPRED預測蛋白rAgaN3的二級結構結果如圖6所示。

圖 6 瓊膠酶二級結構預測Fig.6 Predicted secondary structure of agarase

AA代表了目標蛋白質的氨基酸序列。Pred 代表了二級結構以及相應的圖例(H:Helix；C:Coil；E:Strand)。Conf 數值在1～9 變化，數值越高，置信度越高。由PSIPRED預測結果可知 ：rAgaN3二級結構主要由折疊和卷曲結構構成，其中含有15個折疊結構，其余為卷曲結構。

2.3.2 模體搜索

模體(motif)表示蛋白質中具有特定空間構象和特定功能的結構成分。用BLAST在默認的情況下進行了CD 搜索，向BLASTp提交序列后，獲得的結果如圖7所示。

圖 7 模體結構Fig.7 Motif structure

該瓊膠酶屬于糖苷水解類16家族(GH16)，屬于LamG超家族；有11個活性位點分布于75～262氨基酸之間；有3個催化殘基，3個Ca2+結合位點，但都在活性區域以外，推斷Ca2+對瓊膠酶活性可能無太大的促進作用。

2.4 結構域與功能分析

2.4.1 結構域分析

結構域是蛋白質序列功能、結構和進化的單元，通常由50～300 個氨基酸組成，有空間構象特異性。SMART預測結果如圖8：該蛋白序列56～267 位氨基酸對應于Glyco_hydro_16 的結構域。

圖 8 瓊膠酶結構域Fig.8 Structural domain of agarase

Glyco_hydro_16在PFAM 數據庫的編號為PF00722，進行查看和分析。糖苷水解酶16家族是糖苷水解酶的一個家族。糖苷水解酶(EC 3.2.1)是一類廣泛存在的酶系，水解兩個或以上的糖類。

查詢CAZY數據庫可知，糖苷水解酶16家族由許多具有已知活性的酶組成，包括: 葡聚糖酶、瓊膠酶、透明質酸酶、半乳糖苷酶、卡拉膠酶、木聚糖酶等。

2.4.2 PredictProtein預測蛋白信息

歐洲分子生物學實驗室提供的蛋白質序列和結構預測服務網站 PredictProtein，可以得到蛋白質多序列比對、低復雜區、溶劑可及性、跨膜螺旋、卷曲螺旋區、核定位信號及二級結構等信息。其中跨膜螺旋、二硫鍵、結合位點預測結果分別見圖9、圖10、圖11。

圖 9 跨膜螺旋區域預測Fig.9 Predicted transmembrane domain

圖 10 二硫鍵預測Fig.10 Predicted disulfide bonds

PredictProtein預測得到：rAgaN3 無跨膜螺旋區域，與TMHMM預測結果一致。

PredictProtein預測得到：rAgaN3 無二硫鍵結構。

圖11 結合位點預測Fig.11 Predicted binding sites

PredictProtein預測得到：rAgaN3 存在14 個蛋白質結合位點以及2 個多核苷酸結合位點。

PredictProtein預測分子功能本體論如表3所示。

表 3 分子功能本體論Table 3 Molecular function ontology

分子功能本體論表明：該蛋白可能具有水解酶活性，水解O-糖苷化合物(GO：0004533)；水解酶活性，作用于糖苷鍵(GO：0016798)；β-瓊膠酶活性(GO：0033916)；催化活性(GO：0003824)。可靠性分別為43%、42%、37%,28%和23%。可以推測該蛋白是一種糖苷水解酶，與結構域分析該酶屬于糖苷水解酶GH16結果一致。

PredictProtein生化過程本體論如表4所示。

表 4 生化過程本體論Table 4 Biological process ontology

生化過程本體論表明：該蛋白參與新陳代謝過程(GO：0008152)，最初的新陳代謝過程(GO：0044238)，糖類代謝過程(GO：0005975)和有機物質的代謝過程(GO：0071704)。可靠性分別為35%、27%、27%和27%，可以推測該蛋白參與體內新陳代謝。

2.4.3 亞細胞定位及導肽預測分析

用Target1.1進行亞細胞定位及導肽分析，結果如表5。

表 5 瓊膠酶亞細胞定位Table 5 Subcellular location of agarase

Target1.1預測結果顯示：該蛋白質氨基酸序列長277 個氨基酸，存在線粒體目標肽(mTP)的可能性為7.0%，存在信號肽(SP)的可能性為7.3%，其他導肽或無導肽的可能性為93.4%。目的蛋白rAgaN3 的分泌途徑為—型，即定位在其他細胞器，沒有剪切位點的序列，可靠性級別為1級。與跨膜螺旋區域、信號肽預測結果相匹配。

2.5 蛋白質三級結構預測

2.5.1 同源建模

SWISS-MODEL是目前應用最廣泛的在線同建模網站，利用同源建模的方法實現對未知結構的序列的預測。在PDB數據庫中找到與瓊膠酶rAgaN3 的近同源蛋白3wz1A(MicrobulbiferthermotoleransJAMB-A94 GH16家族，β-瓊膠酶)作為模板。rAgaN3與3wz1A的蛋白序列比對如圖12所示。

圖 12 rAgaN3 與3wz1A 蛋白的序列比對Fig.12 Sequence alignment of rAgaN3 and 3wz1A protein

由圖12可以看出，rAgaN3與模板蛋白序列大部分氨基酸是極保守的，相似程度達到88%，用3wz1A作為同源建模模板準確性較高。用SWISS-MODEL預測得到三維結構，序列從N 端到C 端分別用綠色到紅色表示(見圖13)。可以看出，瓊膠酶rAgaN3的主要由β-折疊構成，整體結構類似“三明治”狀，由15個折疊結構組成，與Allouch等[21]報道過的GH16家族的瓊膠酶β-jelly-roll結構較為類似。

圖 13 瓊膠酶三級結構Fig.13 Tertiary structure of agarase

2.5.2 結構合理性評價

用SAVES服務器對結構進行PROCHECK評價，PROCHECK程序不考慮能量，只檢測結構中的殘基之間角度是否合理，生成Ramachandran plot。檢測結果見圖14。

圖14 拉式圖Fig.14 Ramachandran plot

PROCHECK顯示氨基酸殘基核心區：91.3%，允許區：8.3%，大致允許區：0.4%，禁阻區：0%，位于可接受區的達到了100%，一般位于可接受區的氨基酸殘基大于90%可以認為蛋白結構合理。rAgaN3建模得到的結構符合立體化學的原則，模型各殘基之間的角度很合理。

PROSA程序是檢測蛋白結構能量常用的工具，反映的是結構中殘基之間的能量是否合理。得到的結果一般為負值。程序評價結果見圖15。

圖15 Z-score圖Fig.15 Z-score of rAgaN3

本實驗的Z-score為-7.04(圖中黑點所示)，藍色部分為所有已解析的晶體結構的Z-score分布情況。由圖可知，rAgaN3的Z-score位于中心的位置，說明該結構在能量上是十分合理的。綜合Ramachandran plot和Z-score的結果分析，SWISS-MODEL構建出的瓊膠酶結構是相當可靠的。

3 結論

重組瓊膠酶rAgaN3理論分子量為31.243 kDa，理論等電點為4.81，脂肪系數為62.35，不穩定系數為26.23，小于40，說明蛋白較穩定，總平均疏水性為-0.662，小于0，預測為親水性蛋白；二級結構預測得到：該蛋白無螺旋結構，有15 個折疊結構，其余均為卷曲結構。無信號肽，無跨膜區域也沒有二硫橋。根據序列分析表明，rAgaN3屬于糖苷水解酶GH16 家族，為β-瓊膠酶。采用序列比對算法搜索蛋白質結構PDB 數據庫，找到與瓊膠酶rAgaN3的近同源蛋白3wz1A(MicrobulbiferthermotoleransJAMB-A94 GH16 家族，β-瓊膠酶)，序列相似性達到88%。運用同源建模法，使用SWISS-MODEL 構建重組瓊膠酶rAgaN3的三維結構模型，可以認為此瓊膠酶是典型的GH16家族瓊膠酶結構，并用PROCHECK和PROSA進行了結構檢驗。

本研究從瓊膠酶的序列出發，對序列中包含的生物信息進行了系統的研究，預測了瓊膠酶rAgaN3的基本理化性質，為理解瓊膠酶特性提供了參考。后續工作可以本文預測信息為基礎，將基因在大腸桿菌表達系統和畢赤酵母表達系統中進行異源表達，并對重組瓊膠酶的酶學性質進行測定，以驗證生物信息學預測結果。用高同源性的模板同源建模得到的較可靠的蛋白質三維結構，為理解瓊膠酶的結構特性以及催化機制打下了良好的基礎。并且可以從蛋白質的三維結構出發，通過分子對接、分子動力學模擬等方法，以提高比活力以及改善酶學性質為目標，預測潛在的突變位點并進行定點突變實驗，深入研究瓊膠酶結構與功能的關系。

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Bioinformatics analysis of the recombinantrAgaN3 gene of agarase

XIE Yong，HONG Xiaokun，YAN Renxiang，LIN Juan*

(FujianProvincialKeyLaboratoryofMarineEnzymeEngineering(FuzhouUniversity),Fuzhou350116,China)

In this paper, the agarase enzyme gene namedrAgaN3 is analyzed which is cloned fromMicrobulbifersp. BN via various bioinformatics methods. The results show that the calculated molecular mass of reorganization of agaroserAgaN3 is 31.243 kDa, the theoretical isoelectric point is 4.81, 26.23 of the nstability coefficient, 62.35 of the fat index, and minus 0.662 of the average hydrophobic coefficient, and there is no transmembrane domain and no signal peptide. By analyzing the secondary structure of protein, we can find there are 15 β-sheet structures, other coiled structures, and no helical structure. According to the analysis of sequence similarities, we can know rAgaN3 is a β-agarase, belongs to glycoside hydrolase GH16 family. It is templated by a homologous protein 3wz1A (88 homology), sets up tertiary structure of protein by creating homology modeling and tests its structure by Ramachandran Plot and PROSA. The bioinformatics analysis ofrAgaN3 gene of Agarase can provide a guidance to heterologous expression of agarase and lay good foundations for the site-directed mutagenesis of agarase and comprehensive study on the relationship between structure and function.

Agarase; Gene analysis; Bioinformatics; Protein structure

2016-08-20；

2016-10-18.

福建省企業技術創新項目(閩經信投資[2015]205號)；福州市科技計劃項目(No.2016-G-42)。

謝勇，男，碩士研究生，研究方向：微生物學；E-mail：1148494580@qq.com.

*通信作者：林娟，女，教授，博士生導師，研究方向：微生物學及生物化學與分子生物學；E-mail: ljuan@fzu.edu.cn.

10.3969/j.issn.1672-5565.2017.01.201608003

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1672-5565(2017)01-016-11