不同有機肥對煙田土壤微生物的影響

摘要：通過盆栽試驗，探討了孔雀草（Tagetes patula L）在不同濃度鎘（0、100、300、500mg/kg）脅迫及不同時間（50d、70d）可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸含量的變化規律，并分析了三者之間的關系。結果表明：在第50d時，隨鎘脅迫濃度增加，可溶性蛋白含量逐漸升高，在500mg/kg鎘處理下，可溶性蛋白含量達到最大，為6736mg/g；可溶性糖含量呈先降低后升高再降低的趨勢，脯氨酸含量先降低后升高；隨時間延長，在第70d時，可溶性蛋白含量呈先降低后升高再降低的趨勢，可溶性糖含量呈先升高后降低的趨勢，脯氨酸含量呈先降低后升高再降低的趨勢。鎘脅迫下脯氨酸和可溶性糖含量的升高為鎘耐性相關蛋白的合成提供物質基礎，增強了孔雀草耐受重金屬的能力。

關鍵詞：孔雀草；可溶性蛋白；可溶性糖；脯氨酸

中圖分類號：Q9581；S4433（273）

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2017）03-0044-05國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.03.008

Abstract：The effects of different concentrations of cadmium（0，100，300，500mg/kg） on the soluble protein，soluble sugar and proline content in Tagetes patula and their relationship in different time（50 days and 70 days） were studied by pot experimentThe results showed that the soluble protein content increased with the increase of the concentration of cadmium stress on the 50th dayThe soluble protein content reached the maximum，67mg/g，treating by 500mg/kg CdThe soluble sugar content decreased first and then increased，following by a dropProline content decreased first and then increasedThe content of soluble protein decreased first and then decreased more at the 70th day，and the content of soluble sugar increased first and then decreasedThe content of soluble protein increased first and then decreasedProline content decreased first and then increased and then followed by a dropThe increase of proline and soluble sugar content under cadmium stress provides the material basis for the synthesis of cadmium tolerance related proteins，thus enhances the ability of malachite to tolerate heavy metals

Key words：Tagetes patula L；soluble protein；soluble sugar；proline

隨著工業的發展和農業生產的現代化，世界各國土壤都存在不同程度的重金屬污染。土壤重金屬來源于采礦、電鍍、冶煉、化工、染色、電池制造等工廠排出的廢水[1]。當土壤遭受重金屬污染后，不僅會破壞植物的產品和質量，還會通過食物鏈危害人體健康，引發癌癥或其他疾病。目前，應用于土壤重金屬污染的植物修復技術由于具有治理成本低、無二次污染、環境友好和可持續發展等優點，成為國際研究的熱點。

孔雀草（Tagetes patula L）是菊科萬壽菊屬一年生草本植物，適應性強，生長迅速，易于管理，是目前我國主栽花卉之一。研究表明，孔雀草具有鎘（cd）超富集特性，是鎘超富集植物[2，3]，當幼苗在Cd濃度為300mg/L時，地上部Cd含量達到135mg/kg，超過Cd超富集植物的臨界值，轉移系數>1。孔雀草經鎘脅迫處理后，基因組DNA甲基化水平與濃度呈劑量效應關系，隨Cd濃度升高，DNA甲基化模式也發生了變化，重新甲基化率隨Cd濃度升高而提高，去甲基化率則隨脅迫濃度的升高而呈現下降趨勢，且以重新甲基化率的增加為主，最終導致總體甲基化率的升高[4]。任麗萍等[5]利用孔雀草修復治理鎘污染土壤有實質進展，通過反復種植孔雀草，可以連續提取污染土壤中過量的鎘，直到其鎘含量達到環境安全標準。因此，孔雀草對鎘污染地區的生態恢復有著重要意義。

植物體內的滲透調節物質具有調節、保護、清除活性氧等功能，有助于植物抵抗外界因素的脅迫，提高植物的抗逆性，其中，碳水化合物的積累和分解又與植物光合過程的變化息息相關[6]。重金屬脅迫可使可溶性蛋白含量增加，在植物體內特異結合形成多肽，抵抗重金屬對植物的毒害，細胞內可溶性糖能維持胞內正常生理過程的進行，抵抗水分的脅迫；脯氨酸有較強的水合能力，提高細胞持水力，從而降低重金屬毒害對植物細胞的影響。

本實驗以孔雀草對鎘具有超富集能力的特點，采用土培方法，研究不同時間及不同濃度鎘脅迫對孔雀草可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸含量的影響，以期為孔雀草耐鎘機理提供依據。

1材料與方法

11土培實驗

孔雀草（Tagetes patula L）種子購于貴陽綠泉園藝有限公司，選取大小均一且飽滿的種子用75%乙醇消毒2～3min。蒸餾水沖洗數次，播種15粒種子于直徑15cm，高12cm的花盆中，每盆土重05kg。按照100mg/kg、300mg/kg、500mg/kg Cd2+濃度稱取氯化鎘（CdCl2·25H2O），分別溶于適量蒸餾水中并澆灌土壤，每個處理設置4個重復，以蒸餾水處理組作為對照組。脅迫50d、70d后，分別取各濃度地上部用于可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸含量的測定。

12測定方法

121可溶性蛋白含量測定可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G250染色法[7]。稱取不同處理的孔雀草地上部鮮樣01～05g，加入磷酸緩沖液2mL研磨成勻漿后，再加入8mL磷酸緩沖液沖洗研缽，室溫靜置1h，充分提取，4000r/min離心15min，吸取上清液10mL，加入50mL考馬斯亮藍，充分混合，放置2min后，待反應完成，在595nm下比色，測定吸光度，并通過標準曲線計算可溶性蛋白質含量。每個處理重復三次。

122可溶性糖含量測定可溶性糖含量測定采用苯酚-硫酸法[8]，稱取不同處理的孔雀草地上部鮮樣01～05g，放入試管中，加入10mL蒸餾水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液過濾至25mL容量瓶中，反復沖洗試管及殘渣，定容至刻度。吸取05mL樣品液于試管中（重復2次），加蒸餾水15mL，依次向試管中加入1mL 9%苯酚溶液，5mL濃硫酸，充分振蕩，在室溫下放置30min，485nm波長下比色，測定吸光度，并通過標準曲線計算可溶性糖含量。每個處理重復三次。

123脯氨酸含量測定脯氨酸含量測定采用磺基水楊酸法[9]。準確稱取不同處理孔雀草地上部01～05g，分別置于試管中，然后向各管分別加入5mL 3%的磺基水楊酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取過程中要經常搖動），冷卻后過濾于干凈的試管中，濾液即為脯氨酸的提取液。吸取2 mL提取液于另一干凈的帶玻塞試管中，加入2mL冰醋酸及2mL酸性茚三酮試劑，在沸水浴中加熱30min，冷卻后加入4mL甲苯，振蕩以萃取紅色物質，靜置待分層后吸取甲苯層在波長520nm處比色，求得吸光度值，并通過標準曲線計算脯氨酸含量。每個處理重復三次。

13數據處理與統計分析方法

數據分析采用Excel 2010計算，用GraphPad Prism7進行生物制圖。

2結果與分析

21不同濃度鎘脅迫對孔雀草地上部可溶性蛋白含量的影響

植物體內的可溶性蛋白質大多是參與各種代謝的酶類，在受到重金屬脅迫時，它們的含量會發生變化，測定其含量是了解植物抗逆性的重要指標。經不同時間及不同濃度鎘脅迫處理后，孔雀草地上部可溶性蛋白含量變化如圖1所示。在第50d時，三個濃度處理下的孔雀草可溶性蛋白含量逐漸上升，在500mg/kg鎘處理下，可溶性蛋白含量達到最大，為6736mg/g，說明不同濃度鎘脅迫下，孔雀草體內為適應鎘脅迫而誘導相關蛋白合成，從而表現為可溶性蛋白含量逐漸升高；第70d時，隨鎘處理濃度的增加，可溶性蛋白含量呈下降趨勢，各濃度處理的孔雀草可溶性蛋白含量均低于對照組，在300mg/kg鎘處理下，可溶性蛋白含量有了明顯的上升，達到3264mg/g。在各鎘溶液處理下，孔雀草可溶性蛋白含量均隨時間延長而降低，差異不顯著，在對照組，可溶性蛋白含量下降了1683mg/g，在100mg/kg鎘處理下，可溶性蛋白含量下降了3435mg/g，在300mg/kg鎘處理下，可溶性蛋白含量下降了5582mg/g，在500mg/kg鎘處理下，可溶性蛋白含量下降了5008mg/g，說明鎘通過減緩孔雀草體內蛋白質的合成對其造成傷害。

22不同濃度鎘脅迫對孔雀草地上部可溶性糖含量的影響

經不同時間及不同濃度鎘處理后，孔雀草地上部可溶性糖含量變化如圖2所示。在第50d時，隨鎘處理濃度的增加，孔雀草可溶性糖含量呈先降低后升高再下降趨勢，在300mg/kg鎘處理下，孔雀草可溶性糖含量略高于對照組，說明低濃度的鎘脅迫還不能刺激植物體發生防御反應，導致含量降低，隨著鎘脅迫濃度加大，植物防御機制啟動，可溶性糖作為滲透調節物質來保護細胞免受傷害，適應外界條件變化，因而含量升高，高濃度的鎘脅迫對孔雀草的傷害較大，直接破壞了可溶性糖的分子結構，抑制了可溶性糖的合成，所以含量降低。在第70 d時，隨鎘處理濃度的增加，孔雀草可溶性糖含量呈先升高后降低趨勢，在100、300mg/kg鎘處理下，孔雀草可溶性糖含量略高于對照組。在300、500mg/kg兩個鎘濃度處理下，可溶性糖含量均隨時間延長而降低，差異不顯著，這與未加鎘處理的對照組表現出相同趨勢。

23不同濃度鎘脅迫對孔雀草地上部脯氨酸含量的影響

脯氨酸是多種質膜和多種代謝酶的保護劑，并可在植物逆境恢復過程中提供碳骨架[9]。經不同時間及不同濃度鎘處理后，孔雀草地上部脯氨酸含量變化如圖3所示。在第50d時，孔雀草在不經鎘脅迫時脯氨酸含量最高為22657μg/g，在100、300、500mg/kg3個鎘濃度處理下，孔雀草脯氨酸含量總體呈上升趨勢，但均低于對照組，脯氨酸含量的上升可視為植物自身的防御反應，為了應對逆境脅迫而產生的保護機制。在70d時，隨鎘濃度增加，孔雀草脯氨酸含量呈先降低后升高再降低的趨勢，在300mg/kg鎘濃度處理下，孔雀草脯氨酸含量高于對照組為15553μg/g。在100、500mg/kg兩個鎘濃度處理下，孔雀草脯氨酸含量隨時間延長而降低，與未加鎘處理的對照組相同。在300mg/kg鎘濃度處理下，孔雀草脯氨酸含量隨時間延長略有上升，但差異不顯著。

3結論與討論

重金屬是一類會對植物產生毒害作用的污染物，植物在長期進化過程中演變出耐受重金屬脅迫的相關機制，來緩解重金屬對植物的脅迫傷害[11]。為了應對脅迫，植物產生的抗氧化劑及非酶抗氧化劑能清除自由基，抵抗活性氧對細胞的損傷，滲透調節物質使植物適應外界環境變化，為各項生命活動正常進行提供相對穩定的內環境；螯合蛋白能與重金屬結合生成絡合物，轉移到細胞質或液泡中達到解毒目的；轉運蛋白參與重金屬吸收、螯合、區室化和代謝利用等關鍵步驟，在植物抵抗重金屬復雜機制中起著關鍵作用。

植物細胞內會主動積累一些可溶性物質來降低胞內滲透勢，如可溶性蛋白及可溶性糖，以保證重金屬脅迫條件下水分的正常供應，脯氨酸通過清除自由基減輕由重金屬引起的氧化脅迫，進而提高植物的耐受性[12-13]，維持細胞正常生理功能[14]。

在鎘脅迫下，有關植物體內可溶性物質變化已有較多報道，但其變化規律并不一致，有研究表明油菜的3個品種在不同濃度鎘脅迫下，可溶性蛋白含量均低于對照組[15]；張義賢等[16]研究重金屬對大麥（Hordeum vulgare）幼苗可溶性糖含量影響表明，大麥幼苗根內可溶性糖隨重金屬濃度增加而降低。本研究表明，孔雀草在不同濃度鎘脅迫第50d時，可溶性蛋白含量呈升高趨勢，可溶性糖含量呈先降低后升高再降低趨勢，脯氨酸含量呈先降低后升高趨勢。Bartolf M等[17]認為植物細胞中可溶性蛋白可與重金屬離子結合形成金屬結合蛋白，從而降低植物細胞中游離態重金屬離子的含量，以減輕重金屬離子對植物細胞的傷害，同時可溶性蛋白含量增加，可以提高功能蛋白數量，增加細胞滲透勢，提高植物整體的抗逆性；糖是參與調節滲透脅迫的小分子物質，在植物對重金屬的適應性調節中，是增加滲透性溶質的重要組成部分。起初低濃度的鎘離子還不能引起植物體內發生防御性反應，而是直接破壞了可溶性糖分子結構或抑制可溶性糖合成，所以可溶性糖含量下降，隨Cd脅迫濃度增加，植物的防御機制啟動，可溶性糖作為滲透調節物質來保護細胞免受損傷，維持原有的生理過程，適應外界環境變化；低濃度的鎘脅迫對脯氨酸具有抑制作用，隨著鎘脅迫濃度增加，脯氨酸含量均呈先降低后升高趨勢，這與張浩等[18]研究不同土壤重金屬脅迫對煙葉脯氨酸含量影響的結果一致，說明脯氨酸在重金屬脅迫條件下有調節植物細胞滲透平衡、維持對蛋白質結構穩定、清除活性氧的作用。

孔雀草在鎘脅迫下第70d時，可溶性蛋白含量呈先降低后升高再降低趨勢，可溶性糖含量呈先升高后降低趨勢，脯氨酸含量呈先降低后升高再降低趨勢，可溶性蛋白含量降低可能是蛋白質與氧自由基反應導致個別氨基酸的改變、多肽分裂及蛋白水解造成的，活性氧、氨基酸側鏈的氧化及脂質過氧化反應醛產物的二次反應都會影響蛋白質的功能特性[15]；隨時間延長，Cd脅迫濃度增加，對細胞膜系統的破壞加劇，細胞失水嚴重，此時植物體主要通過可溶性糖等物質提高細胞滲透壓，為各項生命活動的進行提供相對穩定的內環境[19]；脯氨酸含量在達到高峰值后降低可能與高濃度的鎘脅迫會損傷細胞內多種功能膜及酶系統，造成脯氨酸合成代謝紊亂。

在100mg/kg鎘濃度處理下，三種滲透調節物質隨時間延長而降低，其中可溶性糖含量降幅不大，說明在低濃度鎘處理下，植物主要依賴可溶性蛋白及脯氨酸調節細胞滲透勢，在300mg/kg鎘濃度處理下，只有脯氨酸含量略有升高，可溶性蛋白及可溶性糖含量下降，此時，植物細胞內可溶性蛋白及可溶性糖分解，脯氨酸大量合成，減緩重金屬對植物的傷害，在500mg/kg鎘濃度處理下，三種滲透調節物質含量隨時間延長均降低，此時，可溶性蛋白及可溶性糖合成緩慢，脯氨酸也降到最低，直接影響植物的生長、發育過程。

有研究表明，逆境脅迫下可溶性蛋白分解加速，分解為游離脯氨酸等其他物質，使脯氨酸含量升高。重金屬脅迫下，由于外界滲透勢較低，植物會發生失水現象，為了避免滲透傷害，植物細胞會主動吸收和積累一些無機鹽和可溶性物質如游離脯氨酸來降低胞內滲透勢，避免因失水而導致的傷害。本研究中孔雀草在較高濃度的鎘脅迫下游離脯氨酸含量逐漸升高可能與此有關，具體原因仍須進一步分析。

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