金邊窗螢頭部特征的掃描電鏡觀察

摘要：為探究蟲生真菌蟬花不同菌株之間產(chǎn)絮凝劑的差異及絮凝劑的絮凝特性，以高嶺土法對(duì)36株蟬花菌株進(jìn)行了高產(chǎn)絮凝劑的篩選及高產(chǎn)菌株的生長(zhǎng)特性和絮凝性質(zhì)的研究。實(shí)驗(yàn)篩選出穩(wěn)定、高產(chǎn)絮凝劑的蟬花菌株GZUIFR-6722，絮凝劑活性物質(zhì)是其胞外聚合物。該菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中生物量的積累和產(chǎn)絮凝劑能力呈正相關(guān)。當(dāng)菌株6722絮凝劑投加量為12mL每50mL時(shí)，絮凝效果較好，絮凝率可達(dá)9147%。1%的CaCl2能顯著促進(jìn)絮凝效果，絮凝率可達(dá)9489%。顛倒次數(shù)、靜置時(shí)間、溫度以及pH對(duì)絮凝效果影響不顯著。

關(guān)鍵詞：微生物絮凝劑；蟬花；絮凝特性

中圖分類號(hào)：X172

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2017）03-00-0國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.03.001

Abstract：The aim of this paper is to study the bioflocculability and characteristics of different strains of Isaria cicadae by screening all 36 strains with kaolinThe results showed that GZUIFR-6722 strain can perform steadily with high bioflocculabilityThe active substrate was identified as some kind of extracellular metaboliteDuring the growth，the production of active substrate was related positively with the biomassThe flocculating rate was 9147% after addition of 12mL/50mL bioflocculantsMoreover，the addition of 1% CaCl2 could promote the performance of the bioflocculants，and increased the flocculating rate to 9489%Furthermore，the results also indicated that inversion，standing time，temperature and pH had no obvious effect on flocculationThe findings suggest for application of the GZUIFR-6722 strain in the treatment of waste water

Key words：microbial flocculants；Isaria cicadae；flocculation characteristics

蟬花（蟬棒束孢Isaria cicadae）是一種蟲草類真菌，對(duì)蚜蟲、小菜蛾、白粉虱等害蟲的防治效果較好[1，2]，同時(shí)也是一味傳統(tǒng)名貴中藥，在糖尿病、抗腎纖維化進(jìn)程、延緩腎衰竭等的臨床及實(shí)驗(yàn)研究中，取得了較好效果[3，4]。迄今為止，對(duì)蟬棒束孢透明質(zhì)酸、多糖及糖蛋白等活性物質(zhì)[5-7]和抗衰老、改善免疫功能等[8，9]在醫(yī)療和保健上已有大量的研究報(bào)道，因此，蟬花是一種極具應(yīng)用前景的高安全性的真菌資源。除此之外，也有研究發(fā)現(xiàn)蟬花能產(chǎn)生絮凝劑，郭旭輝等[10]率先發(fā)現(xiàn)蟬花發(fā)酵液具有絮凝活性，采用pH為70的馬鈴薯液體培養(yǎng)基150r/min、30℃搖床培養(yǎng)84h后絮凝率可達(dá)851%。孫嘉龍等[11]從土壤中分離到一株具高效絮凝活性的菌株3716，并對(duì)其培養(yǎng)條件與絮凝活性進(jìn)行了研究，由此可見，蟬花的絮凝能力也可用于微生物絮凝劑的開發(fā)。

微生物絮凝劑被稱為繼無(wú)機(jī)絮凝劑和合成有機(jī)高分子絮凝劑之后的第三代絮凝劑[12]，是由微生物產(chǎn)生、經(jīng)分離和提純獲得的具有絮凝活性的次生代謝產(chǎn)物[13]，其有效成分一般為多糖、蛋白質(zhì)、脂類和核酸等生物大分子[14，15]。相對(duì)于傳統(tǒng)的無(wú)機(jī)及合成高分子絮凝劑而言，微生物絮凝劑具有易降解、安全無(wú)毒以及無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)。與微生物絮凝劑相比，無(wú)機(jī)和合成有機(jī)高分子絮凝劑對(duì)環(huán)境不可避免的破壞限制了它們的應(yīng)用[16]。因此，從環(huán)境安全角度考慮，微生物絮凝劑是目前絮凝劑產(chǎn)品中的研究熱點(diǎn)，是一類極具發(fā)展前途的水處理劑[17]，可廣泛應(yīng)用于飲用水、食品廢水、醫(yī)藥廢水及重金屬?gòu)U水等領(lǐng)域[18-20]。微生物絮凝劑生產(chǎn)菌來(lái)源廣泛，目前已報(bào)道了50余種絮凝劑生產(chǎn)菌[21]，分別屬于細(xì)菌、真菌、放線菌及藻類，其中以細(xì)菌和真菌占絕大部分。篩選更安全有效的絮凝劑生產(chǎn)菌、降低菌株產(chǎn)絮凝劑成本、探究絮凝機(jī)理是目前微生物絮凝劑領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。為豐富真菌絮凝劑菌株資源庫(kù)，本文著眼于安全性更高、更具特色的蟲草類真菌絮凝劑進(jìn)行研究。

蟲生真菌蟬花具有優(yōu)越產(chǎn)絮凝劑性質(zhì)，但考慮到研究所用的菌株不同，菌株之間的絮凝能力也會(huì)存在差異。本文對(duì)來(lái)自貴州大學(xué)真菌資源研究所的36株蟬花菌株產(chǎn)絮凝劑能力和絮凝條件進(jìn)行了探索。

1材料與方法

11材料

111菌株用于實(shí)驗(yàn)的36株蟬花菌株（表1），現(xiàn)保存于貴州大學(xué)真菌資源研究所（GZUIFR）。菌株來(lái)自全國(guó)各地及韓國(guó)濟(jì)州島（JZD）。

112培養(yǎng)基aPDA（g/L）：土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂15～18g；b液體培養(yǎng)基（g/L）：PDA中去除瓊脂。

12蟬花高產(chǎn)絮凝劑菌株的篩選

121菌株培養(yǎng)將蟬花菌株活化，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5～7d后用無(wú)菌水洗下平板上的孢子，調(diào)整濃度為1×106個(gè)/mL，接種到液體培養(yǎng)基。每株3個(gè)平行，放置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，140r/min、25℃條件下培養(yǎng)，7 d后取發(fā)酵液用于絮凝試驗(yàn)。

122絮凝率的測(cè)定在50mL的比色管中加入49mL 4g/L的高嶺土懸濁液、1mL蟬花發(fā)酵液，將比色管顛倒10次，每次以氣泡上升完畢為準(zhǔn)，靜置20min，取液面1cm以下液體，在550nm處測(cè)定吸光值（B），以添加蒸餾水的吸光值（A）為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)平行樣；確定發(fā)酵液的絮凝活性，用絮凝率E（%）來(lái)表示[22]。絮凝率計(jì)算公式：絮凝率E（%）=（A-B）/A×100%。

13菌株GZUIFR-6722活性物質(zhì)的分布測(cè)定

取培養(yǎng)7d后的成熟發(fā)酵液，分別測(cè)定發(fā)酵原液、6000r/min離心10min后的上清液、懸浮在等量蒸餾水中的菌絲段、蒸餾水洗滌3～5次后懸浮在等量蒸餾水中的菌絲段以及洗滌液共5種組分的絮凝率[23]。

14菌株GZUIFR-6722生長(zhǎng)特性

141液體發(fā)酵的生長(zhǎng)曲線測(cè)定對(duì)液體發(fā)酵培養(yǎng)的菌株6722，每24h取20mL菌液離心獲得菌體，蒸餾水洗滌后，將菌體80℃烘干至恒重，稱其質(zhì)量，設(shè)置三個(gè)平行。同時(shí)進(jìn)行稱重法補(bǔ)水[24]。

142培養(yǎng)時(shí)間對(duì)絮凝劑絮凝活性的影響將菌株6722接種到PDA液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，每1d取樣測(cè)定上清液對(duì)高嶺土的絮凝活性。

143培養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)酵液pH的變化測(cè)定發(fā)酵液的pH的變化，每1d取樣測(cè)定一次。

15絮凝劑的分離純化及絮凝特性、溫度和pH對(duì)蟬花絮凝劑絮凝效果的影響

151絮凝活性物質(zhì)的分離純化取培養(yǎng)7d后的成熟發(fā)酵液，6000r/min離心10min，收集上清液。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，將溫度控制在50℃左右，濃縮發(fā)酵上清液至原體積的1/3左右。加入2倍體積預(yù)冷至4℃的無(wú)水乙醇，輕微振蕩混勻，4℃冰箱中靜置18h。6000r/min離心15min，得到沉淀物用95%乙醇清洗兩次，冷凍干燥得到蟬花絮凝劑[25]，該產(chǎn)品用于絮凝特性和絮凝劑穩(wěn)定性的研究。

152蟬花絮凝劑的投加量對(duì)絮凝劑絮凝活性的影響將蟬花絮凝劑配制成1g/L的絮凝劑。設(shè)置絮凝劑的投加量分別為0、04、08、12、16、20、24、28、32、36、40、44mL，以蒸餾水作為對(duì)照，測(cè)定絮凝率，探究絮凝劑投加量對(duì)絮凝效果的影響。

153不同陽(yáng)離子及陽(yáng)離子的濃度對(duì)蟬花絮凝劑絮凝活性的影響不同陽(yáng)離子類型：配制質(zhì)量濃度為1%的KCl、NaCl、MnCl2、CaCl2、MgSO4五種陽(yáng)離子，以蒸餾水作為對(duì)照，測(cè)定絮凝率，探究不同陽(yáng)離子類型對(duì)絮凝劑絮凝活性的影響。不同陽(yáng)離子濃度：配制質(zhì)量濃度為05、10、15、20、25、30、35%的CaCl2，以蒸餾水作為對(duì)照，測(cè)定絮凝率，探究不同陽(yáng)離子濃度對(duì)絮凝劑絮凝活性的影響。

154顛倒次數(shù)及靜置時(shí)間顛倒次數(shù)：設(shè)置顛倒次數(shù)梯度：5、10、15、20、25、30、35、40次，以蒸餾水作為對(duì)照，測(cè)定絮凝率，探究不同顛倒次數(shù)對(duì)絮凝劑絮凝活性的影響。靜置時(shí)間：設(shè)置靜置時(shí)間梯度：5、10、15、20、25、30、35、40min，以蒸餾水作為對(duì)照，測(cè)定絮凝率，探究不同靜置時(shí)間對(duì)絮凝劑絮凝活性的影響。

155溫度和pH對(duì)蟬花絮凝劑絮凝效果的影響懸浮液溫度：通過(guò)制冷和加熱調(diào)節(jié)高嶺土懸濁液的溫度為10、20、30、40、50、60、70、80、90℃，以蒸餾水作為對(duì)照，測(cè)定絮凝率，探究高嶺土懸濁液溫度對(duì)絮凝效果的影響。懸浮液pH：測(cè)定高嶺土懸濁液的初始pH，用1mol/L的HCl和1mol/L NaOH調(diào)節(jié)高嶺土懸濁液的pH為20、30、40、50、60、70、80、90、100，以蒸餾水作為對(duì)照，測(cè)定絮凝率，探究高嶺土懸濁液pH對(duì)絮凝效果的影響。

2結(jié)果與分析

21蟬花高產(chǎn)絮凝劑菌株的篩選

對(duì)貴州大學(xué)真菌資源研究所保存的36株蟬花進(jìn)行了絮凝能力的測(cè)定（表2），36株蟬花都具有一定的絮凝能力，但不同菌株之間存在著絮凝能力與產(chǎn)絮凝劑穩(wěn)定性之間的差異，以絮凝率為標(biāo)準(zhǔn)，比較多次重復(fù)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)誤差，以標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)衡量菌株產(chǎn)絮凝劑的穩(wěn)定性。篩選出其中產(chǎn)絮凝劑較為穩(wěn)定且絮凝能力較強(qiáng)的菌株為GZUIFR-6722，后續(xù)絮凝性質(zhì)研究以GZUIFR-6722為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

22絮凝活性物的檢測(cè)

絮凝活性物質(zhì)分布測(cè)定結(jié)果如圖1所示，GZUIFR-6722的5種組分絮凝率依次為：上清液（8778±060）%>發(fā)酵原液（8502±236）%>洗滌液（3211±050）%>離心后菌體懸浮液（2437±208）%>清洗后菌體懸浮液（1645±145）%。離心后，上清液絮凝率較發(fā)酵原液稍高；離心后的菌絲體具有一定的絮凝能力，但經(jīng)過(guò)清洗后絮凝率降低，而洗滌液具有了絮凝能力且絮凝率高于菌體懸浮液，說(shuō)明附著在菌體上的絮凝活性物質(zhì)被洗脫到蒸餾水中，上清液的高絮凝率表明GZUIFR-6722產(chǎn)生的絮凝劑主要存在于發(fā)酵上清液中，是由菌體細(xì)胞分泌到胞外的。

23菌株GZUIFR-6722的生長(zhǎng)特性

231菌株GZUIFR-6722培養(yǎng)過(guò)程中的生物量與產(chǎn)絮凝劑相關(guān)性測(cè)定了GZUIFR-6722在培養(yǎng)的8d過(guò)程中，生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)絮凝劑動(dòng)力學(xué)曲線（圖2）。GZUIFR-6722培養(yǎng)到第3d到第4d中生物量只有少量增加，第5d，菌株進(jìn)入穩(wěn)定期后不再生長(zhǎng)，開始累積代謝產(chǎn)物，第6d后菌株進(jìn)入衰老期，生物量開始下降；在培養(yǎng)過(guò)程中，隨著菌株的生長(zhǎng)，菌株的絮凝率隨生物量的累積而增加，最大絮凝率（7962±034）%出現(xiàn)在菌株生長(zhǎng)穩(wěn)定后期至衰老期的第7d，比生物量最大值的時(shí)間延遲，然后急劇下降，可能是菌株由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗而開始分解利用胞外代謝產(chǎn)物導(dǎo)致。總的來(lái)說(shuō)，GZUIFR-6722的生物積累和產(chǎn)絮凝劑能力成正相關(guān)。

232菌株GZUIFR-6722培養(yǎng)過(guò)程中pH的變化GZUIFR-6722在生長(zhǎng)過(guò)程中，pH呈現(xiàn)出一個(gè)先下降后趨于穩(wěn)定（圖3），可能是菌株在生長(zhǎng)期內(nèi)產(chǎn)生了酸性物質(zhì)而使pH降低[26]，培養(yǎng)前4天pH變化呈顯著性降低，在第4天發(fā)酵液的pH最低，為（416±032）。

24蟬花絮凝劑的絮凝特性

241蟬花絮凝劑投加量對(duì)絮凝效果的影響蟬花絮凝劑的不同投加量對(duì)其絮凝效率的影響不同（圖4）。當(dāng)絮凝劑的投加量為04～12mL/50mL時(shí)，絮凝率隨投加量的增加而增加，并在12mL時(shí)達(dá)到最高值（9147±243）%；但在12～44mL/50mL時(shí)，絮凝率隨投加量的增加反而降低，可能是當(dāng)絮凝劑的添加量增加后，大顆粒被吸附的聚合物包圍，懸浮物之間達(dá)到了一種新的相互排斥的電荷平衡，導(dǎo)致絮凝率下降[27]。

242不同陽(yáng)離子及陽(yáng)離子的濃度對(duì)絮凝效果的影響

2421不同陽(yáng)離子類型Junichi T等[28]研究表明，絮凝體系中，不同的陽(yáng)離子類型對(duì)微生物絮凝劑的絮凝效果影響不同。圖5顯示了5種不同陽(yáng)離子對(duì)蟬花絮凝劑的影響。結(jié)果顯示：與對(duì)照相比，5種陽(yáng)離子對(duì)蟬花絮凝劑都有一定促進(jìn)作用，其中CaCl2的效果最為顯著，絮凝率高于對(duì)照1839%，后續(xù)以CaCl2作為蟬花絮凝劑的陽(yáng)離子助劑進(jìn)行研究。

2422不同CaCl2濃度不同濃度的CaCl2對(duì)蟬花絮凝劑的影響效果不同（圖6），添加CaCl2后于對(duì)照相比差異顯著，其中CaCl2濃度為1%時(shí)促進(jìn)效果最為明顯，絮凝率達(dá)（9489±258）%。后續(xù)的研究陽(yáng)離子助劑CaCl2的濃度為1%。

243顛倒次數(shù)及靜置時(shí)間對(duì)絮凝效果的影響

2431靜置時(shí)間微生物絮凝劑與高嶺土作用時(shí)，會(huì)形成大量的絮體，這些絮體的沉降需要一定的時(shí)間。在一定的靜置時(shí)間內(nèi)，蟬花絮凝劑與高嶺土形成的絮凝體隨著靜置時(shí)間的延長(zhǎng)而相繼沉降，10min后絮凝率最大且不同處理之間沒(méi)有顯著差異。因此后續(xù)的實(shí)驗(yàn)靜置時(shí)間為10min。

2432顛倒次數(shù)顛倒次數(shù)就是對(duì)整個(gè)絮凝體系混勻程度的研究。顛倒次數(shù)從5～40次，蟬花絮凝劑的絮凝率均大于92%，不同顛倒次數(shù)之間沒(méi)有顯著差異，因此之后的實(shí)驗(yàn)顛倒次數(shù)為5次。

244溫度和pH對(duì)蟬花絮凝劑絮凝效果的影響

2441懸浮液溫度設(shè)置不同的高嶺土懸浮液溫度，探究蟬花絮凝劑在應(yīng)用過(guò)程中對(duì)懸浮液溫度的穩(wěn)定性（圖7）。蟬花絮凝劑對(duì)懸浮液溫度較為穩(wěn)定，懸浮液溫度在10～90℃之間，蟬花絮凝劑的絮凝率維持在93%以上，方差分析顯示各個(gè)溫度之間差異不顯著，蟬花絮凝劑對(duì)溫度較為穩(wěn)定。在實(shí)際水處理中，可以不考慮溫度對(duì)蟬花絮凝劑效果的影響。

2442懸浮液pH實(shí)際水處理中，由于處理不同的原料以及處理工序的不同，產(chǎn)生的水會(huì)有不同的酸堿度，會(huì)影響絮凝劑的使用效果。設(shè)置不同的懸浮液的pH，探究蟬花絮凝劑在使用過(guò)程中對(duì)懸浮液pH的穩(wěn)定性（圖8）。結(jié)果顯示：pH在2～10范圍之間，絮凝效果均維持在90%以上。相較于堿性環(huán)境下，弱酸性環(huán)境下的絮凝效果較優(yōu)，調(diào)節(jié)pH在2～9后的高嶺土懸浮液與對(duì)照相比，絮凝率差異不顯，蟬花絮凝劑對(duì)懸浮液pH較為穩(wěn)定。在實(shí)際的水處理中，當(dāng)pH在2～10之間時(shí)，這種較小的差異可以忽略不計(jì)，可以不考慮pH對(duì)蟬花絮凝劑效果的影響。

3結(jié)論與討論

本研究篩選出一株能穩(wěn)定高效產(chǎn)絮凝劑的蟬花菌株GZUIFR-6722，分析了菌株產(chǎn)生絮凝劑活性物質(zhì)的分布，發(fā)現(xiàn)活性物質(zhì)是其胞外產(chǎn)物，與多數(shù)真菌生產(chǎn)絮凝劑一致[13，25]。方差分析顯示溫度和pH對(duì)蟬花絮凝劑效果的影響差異不顯著，猜測(cè)該絮凝劑可能是受溫度和pH影響較小的胞外多糖，對(duì)胞外多糖的組成及理化性質(zhì)的研究將有助于了解絮凝劑的絮凝機(jī)理，胞外多糖的提取方法不同會(huì)導(dǎo)致提取量也不同[13]，后續(xù)研究有待建立起蟬花胞外多糖的溫和、高效、操作簡(jiǎn)單的提取方法。在生長(zhǎng)過(guò)程中，GZUIFR-6722生物量的積累和產(chǎn)絮凝劑能力成大致的正相關(guān)，該性質(zhì)有利于在蟬花絮凝劑工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中調(diào)控絮凝劑的生產(chǎn)技術(shù)，在低細(xì)胞死亡率的前提下，最大程度地提取出蟬花絮凝劑。CaCl2作為陽(yáng)離子助劑能顯著促進(jìn)蟬花絮凝劑的效果，與前人研究一致[11]。顛倒次數(shù)和靜置時(shí)間對(duì)絮凝效果的影響差異不顯著，顛倒5次，靜置10min的絮凝率達(dá)（9415±208）%，在水處理過(guò)程中可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)一步達(dá)到節(jié)約人力物力的效果，且蟬花絮凝劑對(duì)溫度和pH不敏感，所以在實(shí)際的水處理過(guò)程中不用考慮溫度和pH對(duì)該絮凝劑的影響，減少對(duì)溫度和pH調(diào)節(jié)，可極大地節(jié)約資源成本和使處理程序簡(jiǎn)約化。

目前，微生物絮凝劑由于生產(chǎn)成本較高，絮凝劑產(chǎn)量較低等因素在根本上限制了其在實(shí)際工業(yè)中的應(yīng)用[29]，后續(xù)研究應(yīng)集中在GZUIFR-6722高產(chǎn)絮凝劑的快速、低成本培養(yǎng)方法，使其有望進(jìn)一步應(yīng)用水處理領(lǐng)域。

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