小鼠局灶性腦缺血再灌注后IL-33及其受體的時(shí)程表達(dá)

肖 偉， 羅 藝

小鼠局灶性腦缺血再灌注后IL-33及其受體的時(shí)程表達(dá)

肖 偉1， 羅 藝2

目的 檢測(cè)白細(xì)胞介素-33(IL-33)及其膜受體ST2和可溶型受體sST2在小鼠局灶性腦缺血再灌注后不同時(shí)程的表達(dá)特征。方法 利用線栓法閉塞大腦中動(dòng)脈(MCAO)30 min誘導(dǎo)建立小鼠可逆性局灶性腦缺血再灌注損傷模型，通過(guò)半定量RT-PCR檢測(cè)腦缺血再灌注后6 h、24 h和3 d缺血腦組織中IL-33及其膜受體ST2、凋亡相關(guān)蛋白Caspase-8和Caspase-3的mRNA表達(dá)水平，并通過(guò)免疫組織化學(xué)染色觀察了IL-33在不同缺血腦區(qū)(運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)、感覺(jué)皮質(zhì)、海馬和紋狀體)的時(shí)程表達(dá)情況；ELISA法檢測(cè)了小鼠MCAO模型再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)血清中IL-33及其可溶型受體sST2的表達(dá)水平。結(jié)果 IL-33 mRNA在缺血后6 h和3 d表達(dá)減少，但在24 h無(wú)明顯改變；凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspase-8 在缺血后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著增高，且Caspase-3在6 h和3 d的m RNA表達(dá)水平較24 h高；ST2 mRNA在缺血后6 h無(wú)減少，但在24 h和3 d有明顯減少；除了MCAO 24 h組運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)和紋狀體陽(yáng)性染色增加外，IL-33陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在缺血后不同時(shí)程各腦區(qū)均有不同程度減少；缺血后外周血中IL-33的表達(dá)量無(wú)明顯升高或降低，而sST2的表達(dá)水平在缺血后6 h即已顯著升高。結(jié)論 腦缺血再灌注后IL-33/ST2信號(hào)通路被下調(diào)，其與sST2表達(dá)增多的效應(yīng)發(fā)揮和神經(jīng)元凋亡有關(guān)。

腦缺血再灌注； 大腦中動(dòng)脈栓塞； 白細(xì)胞介素-33； ST2受體； 神經(jīng)元凋亡

Neuronal apoptosis

白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)-33是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的IL-1家族新成員，它作為細(xì)胞因子，可通過(guò)IL-33/ST2信號(hào)通路促進(jìn)Th2型免疫反應(yīng)，同時(shí)也是一種核蛋白，可參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[1，2]。在炎性刺激下，IL-33還可以作為一種“警報(bào)素”警示組織損傷或應(yīng)激[3]。IL-33是ST2受體的唯一特異性配體，其生物學(xué)活性的發(fā)揮主要依賴于和跨膜型ST2受體(ST2)的結(jié)合，另有一種可溶型ST2(sST2，可溶性血清基質(zhì)裂解素)作為IL-33的誘騙受體可抑制IL-33/ST2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]。IL-33調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的作用具有多樣性，取決于不同的疾病和模型。IL-33可促進(jìn)Th2型炎癥性疾病的發(fā)病，如哮喘、特應(yīng)性皮炎和過(guò)敏反應(yīng)等，然而在一些與Th2型免疫反應(yīng)相關(guān)的疾病或模型，如動(dòng)脈粥樣硬化、多發(fā)性硬化和實(shí)驗(yàn)性腸炎等，IL-33可通過(guò)促進(jìn)Th1/Th2平衡向Th2偏移而起到保護(hù)性作用[4]。此外，新近研究還發(fā)現(xiàn)了IL-33可調(diào)節(jié)Th17型免疫應(yīng)答[5]。IL-33在多組織器官高表達(dá)，而腦和脊髓是IL-33表達(dá)量最高的器官之一，提示IL-33在調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的病理生理學(xué)過(guò)程中可能起著重要作用[1]。近年來(lái)，有關(guān)IL-33或IL-33/ST2信號(hào)通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用是神經(jīng)免疫學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。

缺血性腦卒中是中老年人常見(jiàn)的腦血管疾病，可以導(dǎo)致腦組織損傷并伴隨炎癥反應(yīng)，從而引發(fā)一系列癥候群。研究表明，中國(guó)北方人群IL-33基因單核苷酸多態(tài)性與缺血性腦卒中具有相關(guān)性，提示了IL-33可能參與了缺血性腦卒中的炎性病理過(guò)程[6]。另有一項(xiàng)研究則發(fā)現(xiàn)，急性腦梗塞患者血清中IL-33水平顯著升高[7]。有研究還發(fā)現(xiàn)，IL-33的表達(dá)減少加劇了糖尿病模型小鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌損傷，提示了其對(duì)缺血再灌注損傷可能是一個(gè)保護(hù)性因素[8]。新近一項(xiàng)臨床研究顯示，血清IL-33低水平表達(dá)與急性缺血性腦卒中患者的大梗死面積和疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[9]。而我們先前的研究也提示，IL-33可通過(guò)促進(jìn)Th2應(yīng)答和抑制Th17應(yīng)答而緩解缺血性腦損傷[10]。由此可見(jiàn)，IL-33/ST2信號(hào)通路在缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。本研究擬在缺血性腦卒中動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，較為全面地分析IL-33及其受體ST2和sST2在腦缺血再灌注后不同時(shí)程的表達(dá)規(guī)律，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)IL-33/ST2信號(hào)通路在缺血性腦損傷發(fā)病中的具體作用提供科研數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康雄性C57BL/6小鼠(武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，使用許可證號(hào)：SYXK(鄂)2004-0025)，8～10 w齡，體重22～28 g，飼養(yǎng)于12 h光照/12 h黑暗環(huán)境中，自由攝食和飲水；栓線(北京東沙生物技術(shù)有限公司，型號(hào)1620-A4)；VECTASTAIN ABC免疫組化試劑盒(Vector Laboratories)；小鼠IL-33抗體(R&D Systems)；TRIZOL試劑盒(MRC公司)；PrimerScriptTMRT Master Mix試劑盒(Takara)；小鼠IL-33和小鼠sST2 ELISA檢測(cè)試劑盒(上海西唐生物)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型的制備 參照Z(yǔ)ea Longa等建立的大腦中動(dòng)脈內(nèi)栓線阻斷法，并結(jié)合我們之前的工作基礎(chǔ)做適當(dāng)改進(jìn)[11，12]。10%水合氯醛溶液(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉動(dòng)物。麻醉后小鼠仰臥位固定，頸部正中切開(kāi)皮膚，鈍性分離各層組織，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，并分離至頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)、頸外動(dòng)脈(ECA)分叉后一段，置線備用。注意仔細(xì)分離以避免損傷迷走神經(jīng)和氣管。用微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾住頸內(nèi)動(dòng)脈，近心端結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈。于頸總動(dòng)脈上剪開(kāi)一小口，將直徑為0.16 mm的尼龍栓線(線頭直徑0.20 ± 0.01 mm)經(jīng)頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈插入至大腦中動(dòng)脈起始部，阻斷右側(cè)大腦中動(dòng)脈血流。栓線插入深度距頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處為(10±0.5)mm。結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈以固定栓線和防止出血。栓塞30 min后緩慢拔出栓線以實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組只進(jìn)行術(shù)前麻醉和血管分離術(shù)，不結(jié)扎及導(dǎo)入線栓。將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和MCAO模型組，每組再根據(jù)術(shù)后存活時(shí)間分為6 h、24 h和3 d三個(gè)亞組，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6～8只。

1.2.2 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估 我們采用Zea Longa評(píng)分法對(duì)MCAO模型動(dòng)物的神經(jīng)行為學(xué)進(jìn)行評(píng)估，并加以改進(jìn)[11]。于處死前進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分(雙盲法)，以判斷模型是否成功。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)功能缺失癥狀，活動(dòng)正常；1分，輕度局灶性神經(jīng)功能缺陷，提鼠尾離地時(shí)手術(shù)對(duì)側(cè)前肢屈曲內(nèi)收；2分，中度局灶性神經(jīng)功能缺陷，行走時(shí)小鼠向手術(shù)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，重度局灶性神經(jīng)功能缺陷，行走時(shí)小鼠肢體向手術(shù)對(duì)側(cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失；5分，死亡。分值越高，說(shuō)明其神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重，評(píng)1～3分視為制備成功的MCAO模型。評(píng)為0分、4分或提前死亡的動(dòng)物均棄之不用。

1.2.3 RT-PCR半定量檢測(cè) 于MCAO模型組術(shù)后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)(6 h，24 h和3 d)取缺血側(cè)腦組織勻漿(假手術(shù)組取同側(cè)腦組織勻漿)，按TRIZOL試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總mRNA。然后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成第一鏈cDNA，用于PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因IL-33、ST2、Caspase-8和Caspase-3(引物序列見(jiàn)表1)。PCR反應(yīng)體系(25 L)包括：cDNA模板 1 L、雙蒸水 8.5 L、2 × PCR mix 12.5 L、上下游引物各1.5 L。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 預(yù)變性4 min后進(jìn)入循環(huán)94 ℃變性 1 min，55 ℃ 退火40 s，72 ℃ 延伸40 s共35個(gè)循環(huán)，最后再延伸72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并采用Quantity One對(duì)條帶進(jìn)行光密度分析。

表1 RT-PCR擴(kuò)增目的基因的引物序列

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色 全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)時(shí)，在10%水合氯醛深度麻醉下，自左心室通過(guò)靜脈套管快速灌注生理鹽水沖洗，待流出清亮液體后，灌注4%多聚甲醛固定液固定15 min。完整取出腦組織，沿冠狀面切取視交叉前后約3 mm厚的腦組織塊，并置于上述固定液中后固定48 h后再移入30%蔗糖溶液中。待組織塊沉底后經(jīng)恒低溫冰凍切片機(jī)作冠狀面連續(xù)切片，片厚20 m。利用VECTASTAIN ABC免疫組化試劑盒(Vector Laboratories)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，單克隆羊抗小鼠IL-33抗體稀釋度為1：50(R&D Systems)。每組動(dòng)物每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選取切片20張，每張切片觀察4個(gè)高倍鏡視野(200×)，用尼康圖像分析系統(tǒng)(NIS-Elements BR 3.1)進(jìn)行圖像分析，記錄IL-33陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA) 在小鼠MCAO模型缺血再灌注后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行眼眶采血，室溫靜置30 min后，1500 r/min 離心10 min，收集血清保存于-80 ℃。按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)采用雙抗體夾心法測(cè)定血清中IL-33和sST2水平。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分結(jié)果 采用改良的Zea Longa 0～5分評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，在MCAO各亞組和假手術(shù)各亞組的小鼠術(shù)前及處死前進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)癥狀的觀察及評(píng)估：(1)所有小鼠在造模前的評(píng)分應(yīng)為0分，否則棄之不用；(2)假手術(shù)各亞組在處死前均未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損體征，評(píng)為0分；(3)MCAO各亞組在處死前的Longa評(píng)分結(jié)果顯示，造模成功率即評(píng)為1～3分的小鼠只數(shù)百分比分別為：MCAO 6 h組76.2%，MCAO 24 h組72.7%和MCAO 3 d組66.7%(見(jiàn)表2)；(4)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組造模成功小鼠的Longa評(píng)分分別為：MCAO 6 h組(2.6±0.2667)，MCAO 24 h組(2.875±0.125)，MCAO 3 d組(2.9167±0.193)，各組間評(píng)分無(wú)顯著學(xué)差異。結(jié)果表明，缺血再灌注后6 h到3 d神經(jīng)功能缺失癥狀穩(wěn)定，并未出現(xiàn)加劇或好轉(zhuǎn)；(5)將造模成功的各亞組的小鼠隨機(jī)分為兩組，分別進(jìn)行半定量RT-PCR和免疫組織化學(xué)染色，所有小鼠均眼眶采血收集血清。

表2 MCAO各亞組處死前的Zea Longa評(píng)分結(jié)果 (單位：只數(shù))

ZeaLonga評(píng)分MCAO6hMCAO24hMCAO3d0分1～3分4～5分216321643165

2.2 IL-33及其受體ST2在缺血腦組織中的mRNA表達(dá)情況 提取MCAO模型缺血再灌注后6 h，24 h和3 d組缺血側(cè)腦組織總RNA，通過(guò)RT-PCR半定量檢測(cè)IL-33及其受體ST2 mRNA表達(dá)情況，對(duì)照為相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)組。此外，檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspase-8在缺血后不同時(shí)程的mRNA表達(dá)情況，以分析IL-33表達(dá)與神經(jīng)元凋亡的相關(guān)性。利用Quantity One軟件對(duì)目的基因和內(nèi)參GAPDH的電泳條帶進(jìn)行光密度比較及分析。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，ST2 mRNA在缺血后6 h無(wú)減少，但在24 h和3 d有明顯減少；IL-33 mRNA在缺血后6 h和3 d表達(dá)減少，但在24 h無(wú)明顯改變；凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspase-8 在缺血后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著增高，且Caspase-3在6 h和3 d的m RNA表達(dá)水平較24 h高(見(jiàn)圖1)。

2.3 IL-33在MCAO模型再灌注后不同時(shí)程各缺血腦區(qū)的表達(dá)情況 通過(guò)免疫組織化學(xué)染色ABC法對(duì)IL-33在短暫性腦缺血再灌注后不同時(shí)程不同腦區(qū)的表達(dá)情況進(jìn)行了觀察。觀察的缺血側(cè)腦區(qū)包括：運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)、感覺(jué)皮質(zhì)、海馬和紋狀體。DAB顯色陽(yáng)性的細(xì)胞呈棕黃色顆粒，顯色陽(yáng)性的毛細(xì)血管呈棕黃色桿狀。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，MCAO 6 h和MCAO 3 d組檢測(cè)到的IL-33陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在四個(gè)腦區(qū)均有不同程度的減少(除了MCAO 6 h組運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)IL-33表達(dá)變化不甚明顯外)。

A：MCAO組和假手術(shù)組(Sham組)術(shù)后6 h、24 h和3 d腦組織中IL-33、ST2、Caspase-8和Caspase-3 mRNA表達(dá)的條帶圖示，以GAPDH作為內(nèi)參；B：IL-33/GAPDH光密度比值柱狀圖；C：ST2/GAPDH光密度比值柱狀圖；D：Caspase-8/GAPDH光密度比值柱狀圖；E：Caspase-3/GAPDH光密度比值柱狀圖；表示該MCAO亞組與其相應(yīng)Sham亞組比較，#表示該MCAO亞組與其它MCAO亞組比較*P<0.05

圖1 IL-33、ST2、Caspase-8和Caspase-3在腦缺血后不同時(shí)程的mRNA表達(dá)情況

Pmc：運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)；Psc：感覺(jué)皮質(zhì)；Hi：海馬；Cpu：紋狀體；Sham：假手術(shù)組。黑色箭頭所指為染色陽(yáng)性細(xì)胞，白色箭頭所指為免疫反應(yīng)陽(yáng)性的毛細(xì)血管。標(biāo)尺：50 m(40倍鏡下)

圖2 IL-33在MCAO模型小鼠各缺血腦區(qū)的表達(dá)情況

圖示為血清中IL-33和sST2表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)柱狀圖。表示該MCAO亞組與其相應(yīng)Sham亞組比較*P<0.05

組別(Groups)鼠數(shù)(n)PmcPscHiCpuMCAO6hMCAO24hMCAO3dSham5551256．48±5．30112．76±7．20?6．23±1．20#50．89±6．985．60±2．54#37．55±6．26#4．63±0．87#57．14±4．163．45±1．98#20．10±4．18#11．07±2．92#37．83±3．1440．75±5．53#129．81±7．67?29．33±4．50#88．42±5．54

記錄于×200高倍鏡視野下。Pmc：運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)；Psc：感覺(jué)皮質(zhì)；Hi：海馬；Cpu：紋狀體；Sham：假手術(shù)組。*表示該組與假手術(shù)組相應(yīng)腦區(qū)比較陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多，#表示該組與假手術(shù)組相應(yīng)腦區(qū)比較陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，P<0.05

在MCAO 24 h組，除了海馬和感覺(jué)皮質(zhì)陽(yáng)性染色減少比較明顯外，運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)和紋狀體的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)反而顯著增加。此外，在MCAO 6 h組的感覺(jué)皮質(zhì)和海馬和MCAO 24 h組的海馬還觀察到了免疫反應(yīng)陽(yáng)性的毛細(xì)血管(見(jiàn)圖2)。MCAO后不同時(shí)間點(diǎn)各腦區(qū)IL-33陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3所示。

2.4 MCAO模型缺血再灌注后不同時(shí)程血清中IL-33及其可溶型受體sST2的表達(dá)情況 通過(guò)ELISA法檢測(cè)了短暫性腦缺血再灌注后不同時(shí)程血清中IL-33和sST2的含量變化。結(jié)果顯示，缺血后外周血中IL-33的表達(dá)量無(wú)明顯升高或降低，而sST2的表達(dá)水平在缺血后6 h即已顯著升高(見(jiàn)圖3)。

3 討 論

缺血性腦卒中的病理生理分期不盡一致，綜合文獻(xiàn)報(bào)道可分為3期：超急性期(1～6 h)，病理改變可逆；急性期(12～24 h)，病變組織軟化，神經(jīng)元大量壞死；延遲期(3～14 d)，病變組織液化，神經(jīng)元凋亡，星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖[13]。結(jié)合在動(dòng)物模型的可行性，本研究選擇MCAO模型缺血再灌注后6 h、24 h和3 d作為研究的時(shí)間點(diǎn)，以模擬短暫性腦缺血后從超急性期、急性期到延遲期的病變發(fā)展過(guò)程。本研究結(jié)果表明，腦缺血再灌注后IL-33/ST2信號(hào)通路被下調(diào)，其與sST2表達(dá)增多和神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)。

本研究首先對(duì)IL-33及其膜受體ST2在短暫性腦缺血后的核酸表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，IL-33和ST2在缺血后表達(dá)的總體趨勢(shì)是下降的，且IL-33隨時(shí)程的表達(dá)變化與細(xì)胞凋亡通路中的主要執(zhí)行基因Caspase-3的表達(dá)趨勢(shì)呈負(fù)相關(guān)的。IL-33和ST2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的亞細(xì)胞定位尚無(wú)定論。有研究表明，IL-33蛋白在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞普遍表達(dá)，而ST2蛋白則僅表達(dá)于神經(jīng)元[1]。但也有研究發(fā)現(xiàn)ST2在膠質(zhì)細(xì)胞尤其是星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞也有表達(dá)[14，15]。神經(jīng)元凋亡或壞死以及膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活化是腦缺血后的重要病理生理學(xué)改變。因此，推測(cè)神經(jīng)元凋亡或壞死可能是導(dǎo)致IL-33表達(dá)減少的主要原因。事實(shí)上，IL-33在細(xì)胞壞死時(shí)可被釋放出來(lái)作為alarmin警示組織損傷或炎癥，但在細(xì)胞凋亡時(shí)，IL-33被caspases剪切促其活性喪失和表達(dá)量減少，提示IL-33在神經(jīng)元凋亡或壞死時(shí)可能表現(xiàn)出不同的改變[3，16，17]。在腦缺血急性期，神經(jīng)元以大量壞死為主要病理改變，IL-33從壞死的神經(jīng)元中釋放出來(lái)可能是導(dǎo)致IL-33在MCAO 24 h表達(dá)量基本正常的原因之一。基于IL-33和ST2受體的表達(dá)均減少，提示短暫性腦缺血后IL-33/ST2介導(dǎo)的Th2型免疫應(yīng)答是下調(diào)的。

腦的功能是有定位的，不同腦區(qū)具有不同的功能。例如，大腦皮質(zhì)主要參與運(yùn)動(dòng)及感覺(jué)功能，紋狀體參與運(yùn)動(dòng)和平衡功能，海馬與學(xué)習(xí)、記憶功能有關(guān)。在之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)短暫性腦缺血后運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)、感覺(jué)皮質(zhì)、海馬和紋狀體的病理改變比較明顯[12]。因此在本研究中，我們還通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法對(duì)這四個(gè)腦區(qū)缺血后IL-33的表達(dá)情況進(jìn)行了初步觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了MCAO 24 h運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)和紋狀體表達(dá)增加外，缺血后IL-33在這四個(gè)腦區(qū)的表達(dá)改變趨勢(shì)都是減少的。IL-33在不同腦區(qū)的不同表達(dá)情況提示了IL-33與不同腦區(qū)的功能有相關(guān)性。海馬與學(xué)習(xí)、記憶以及情緒等功能密切相關(guān)，是對(duì)缺血最敏感的一個(gè)腦區(qū)。從MCAO 6 h到3 d組，海馬區(qū)IL-33的表達(dá)量都是減少的，提示IL-33與學(xué)習(xí)記憶可能有一定的相關(guān)性。阿爾茨海默病(AD)是一種以學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能減退為主要表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。之前有一項(xiàng)研究，發(fā)現(xiàn)AD患者腦組織中IL-33的表達(dá)水平明顯低于正常人群[18]，提示IL-33可能是AD的一個(gè)神經(jīng)保護(hù)性因子。缺血性腦卒中也可以導(dǎo)致認(rèn)知功能改變，即血管性癡呆(VaD)的發(fā)生[19]。結(jié)合本研究結(jié)果，推測(cè)IL-33與腦缺血后認(rèn)知功能減退癥狀的發(fā)生有相關(guān)性。

近年來(lái)，IL-33及其可溶型受體sST2的血清表達(dá)水平與疾病的診斷、預(yù)后判斷等的相關(guān)性已逐漸受到關(guān)注，例如IL-33在預(yù)測(cè)糖尿病腎病并發(fā)癥中的作用、sST2受體作為判斷心力衰竭的生物學(xué)標(biāo)記之一[20，21]。本研究還檢測(cè)了小鼠MCAO模型缺血再灌注后血清中IL-33和sST2的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，缺血后外周血中IL-33的表達(dá)量無(wú)明顯升高或降低，而sST2的表達(dá)水平在缺血后6 h即已顯著升高。sST2受體是抑制IL-33/ST2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的誘導(dǎo)受體，本研究結(jié)果提示，短暫性腦缺血可誘導(dǎo)sST2表達(dá)急性升高，其可能是IL-33/ST2信號(hào)下調(diào)的原因之一，因此sST2是否可作為急性缺血性腦卒中早期輔助診斷和評(píng)價(jià)疾病嚴(yán)重程度的一種新型炎性標(biāo)志物，需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，短暫性腦缺血后IL-33及其受體表達(dá)的時(shí)相特點(diǎn)提示IL-33/ST2信號(hào)通路在缺血性腦損傷的發(fā)病機(jī)制中可能具有重要意義；通過(guò)上調(diào)IL-33/ST2信號(hào)通路可能促進(jìn)損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)，這為缺血性腦損傷的治療開(kāi)拓了新思路。

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Time course expression of Interleukin-33 and its receptors after focal cerebral ischemia/reperfusion in mice

XIAOWei，LUOYi.

(DepartmentofNephrology，TheCentralHospitalofWuhan，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430014，China)

Objective To examine the expression patterns of Interleukin(IL)-33 and its receptor ST2 and soluble ST2(sST2)in the different stages following transient cerebral ischemia. Methods Adult C57BL/6 mice were subjected to either sham-operation or middle cerebral artery occlusion(MCAO)for 30 min. At 6 h，24 h and 3 d after the onset of reperfusion，the expression levels of IL-33，ST2，Caspase-8 and Caspase-3 mRNA in the ischemic brains were examined by semi-quantitative RT-PCR. We also observed the expression of IL-33 in the different ischemic brain areas including the sensory and motor cortex，hippocampus and striatum(caudoputamen). Moreover，the serum levels of IL-33 and sST2 after MCAO in mice were determined by ELISA. Results Compared to the corresponding sham group，the mRNA level of IL-33 was significantly decreased at 6 h and 3 d after MCAO，but not at 24 h，while ST2 mRNA expression was down-regulated at 24 h and 3 d but not at 6 h after MCAO. The expression of Caspase-3 and Caspase-8 was significantly increased from 6 h after MCAO，and the level of Caspase-3 was higher at 6 h and 3 d than 24 h. Moreover，the numbers of IL-33-positive cells were decreased in the different ischemic brain regions，except for the motor cortex and striatum at MCAO 24 h. No obvious changes were examined in the serum level of IL-33，while the level of sST2 was significantly increased at 6 h after MCAO. Conclusion The IL-33/ST2 signaling pathway was down-regulated after cerebral ischemia/reperfusion，which was related to the increased expression of sST2 and neuronal apoptosis.

Cerebral ischemia/reperfusion； Middle cerebral artery occlusion； Interleukin-33； ST2 receptor；

2017-01-15；

2017-02-17

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 81501033)

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院風(fēng)濕與腎內(nèi)科，湖北 武漢 430014；2.武漢大學(xué)中南醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430071)

羅 藝，E-mail：luoyi929@aliyun.com

1003-2754(2017)03-0202-06

R743

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