一種穩定阿爾茨海默病細胞模型的建立方法

曹方圓， 羅德欣， 黃玉雕

一種穩定阿爾茨海默病細胞模型的建立方法

曹方圓1， 羅德欣2， 黃玉雕2

目的 旨在應用不同濃度Aβ1-42誘導新生SD大鼠海馬神經元，建立穩定阿爾茨海默病細胞模型。方法 分離并培養新生24 h內SD大鼠原代海馬神經細胞；分別加入不同濃度Aβ1-42誘導，誘導后采用MTT法觀察細胞活力，選取理想Aβ1-42誘導的海馬神經細胞作為阿爾茨海默病細胞模型；通過免疫熒光技術(IF)鑒定神經元特異性烯醇化酶(NSE)在海馬神經元細胞的表達。結果 Aβ1-42誘導后的海馬神經細胞存活率下降，可導致海馬神經元細胞胞體變形、收縮和細胞膜完整性破壞，胞間網絡結構消失或斷裂，細胞外基質亂不清，神經元大量凋亡；Aβ1-42誘導后的海馬神經細胞存活率下降與Aβ1-42濃度成線性關系；加入不同濃度Aβ1-42(0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L和50 μmol/L)后實驗各組細胞存活率分別為(100.00±0.00)%、(98.55±1.42)%、(90.37±3.25)%，(66.34±2.76)%、(53.23±3.41)%和(41.55±2.37)%，其中20 μmol/L組與0 μmol/L組相比P<0.05，30 μmol/L、40 μmol/L和50 μmol/L組與對照組相比P<0.01。結論 Aβ1-42可導致海馬神經元大量凋亡；Aβ1-42濃度為20 μmol/L誘導的SD大鼠海馬神經元可作為理想的阿爾茨海默病細胞模型。

阿爾茨海默??； Aβ1-42； 海馬神經元； 模型

阿爾茨海默病(AD)的病理學改變主要發生在基底節前腦核海馬區膽堿能神經元，其典型的特征為老年斑、神經元纏結(neurofibrillary tangle，NFT)、突觸缺失和神經元凋亡[1]。老年斑的早期病理學改變機制為細胞外淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)沉積的結果，Aβ沉積后可激活小膠質細胞和星形膠質細胞發生炎癥反應，從而老年斑塊的周圍可見活化的膠質細胞。AD發病時有較多且毒性強的Aβ1-42產生。本研究旨在應用不同濃度Aβ1-42誘導SD大鼠原代海馬神經元建立穩定阿爾茨海默病細胞模型。為進一步從細胞分子水平研究AD提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SD新生24 h內大鼠，體重約5～8 g，所有大鼠已通過哈爾濱醫科大學動物管理委員會批準并由哈爾濱醫科大學附屬第二醫院實驗動物中心提供。

1.2 試劑 NEUROBASAL TM AMediu(GIBCO公司)；DMEM/F12(Hyclone公司)；B27添加劑(GIBCO公司)；特級胎牛血清(澳洲血源)(北京元亨金馬公司)；Beta-Amyloid(1-42)peptide(北京奧博森公司)；胰酶細胞消化液(北京碧云天)；35 mm培養皿(corning公司)。大鼠抗兔一抗NSE試劑盒(Sigma公司)；抗大鼠二抗試劑盒(PV-6002)(北京中杉金橋公司)；MTT(Amresco公司)；DMSO(Amresco公司)；多聚甲醛(天津市光復精細化工研究所)。

1.3 原代培養 健康SD新生24 h內大鼠，體重約5～8 g；75%酒精消毒斷頭后線剪剪去皮膚，剪開顱骨，彎鑷翻出大腦后，延縱裂分別向兩側翻開大腦半球，在底部可見新月形的海馬；取出并置于冰浴的PBS液中，剝離其周圍組織和血管膜；用PBS液沖洗干凈后，在用組織剪將其剪成1 mm3的左右組織塊(以上各步驟均在冰盒上進行)[2]。向組織內加入適量37 ℃溫浴100% DMEM/F12培養液+0.5%胰酶消化液，置于37 ℃水浴箱內10～15 min，隨后加入含80% DMEM/F12+20%特級胎牛血清的培養液終止消化；PBS液沖洗后加入種植培養液3～5 ml，用火焰刨光的長玻璃吸管輕輕吹打成混懸液，并以200目無菌不銹鋼網篩過濾，低溫高速離心機1000 r/min離心5 min；棄上清后以種植培養液重懸，計數后以2×106/ml的密度種植與35 mm培養皿內；將種植好的細胞置于37 ℃，95% O2+5% CO2培養箱中培養；培養6～8 h待細胞貼壁后，將種植培養基換成含體積分數98% NEUROBASAL TM AMediu+2% B27的維持培養液；隨后每隔36～48 h全量換液。

1.4 神經特異性烯醇化酶(NSE)鑒定 將蓋玻片切割成0.5 cm×0.5 cm，經泡酸后反復應用雙蒸水沖洗干凈，而后置于75%的酒精中浸泡30～60 min，取出后于高壓蒸汽鍋內消毒，于超凈臺中取出后平鋪于35 mm培養皿中加入濃度為0.01 mg/ml多聚賴氨酸溶液，室溫放置3 h或過夜，而后移除多聚賴氨酸溶液并用滅菌水或PBS等清洗3遍后待用。將分離的海馬神經元以2×106/ml的密度種植于備用的35 mm培養皿中，以上述培養方法培養7 d。蓋玻片移入24孔板內，每孔加入1～2 ml 4%多聚甲醛，于4 ℃冰箱內固定15～20 min或更長時間。移除固定液后以PBST(0.1%吐溫)洗滌3次，每次3～5 min；0.2%的Triton-PBS通透20 min，移除后PBS液洗滌3次，每次3～5 min。1%BSA(10%山羊血清)的PBS液封閉90 min。用含1%BSA PBS稀釋大鼠抗兔子來源的神經特異性烯醇化酶(NSE)(1：100)，37 ℃培養箱內靜置60 min或4 ℃冰箱內過夜。移除一抗后PBS液沖洗3次；含1%BSA的PBS液以1：200的濃度稀釋的抗大鼠二抗(PV-6002)作用90 min。移除二抗后PBS沖洗；以1：1000 DAPI液染核15 min后，PBS液沖洗?？勾銣鐒┓馄笤诩す夤簿劢癸@微鏡下仔細觀察并記錄。

1.5 分組 原代海馬神經細胞培養5 d后，將其轉移至96孔板內并以接種密度為1×104/孔的密度接種，待細胞貼壁(12～24 h)后，將細胞分為6組并分別加入由三蒸水+Aβ1-42配制成的不同濃度溶液。最終向各組加入Aβ1-42的濃度分別為：對照組(A組)0 μmol/L、實驗1組(B組)10 μmol/L、實驗2組(C組)20 μmol/L、實驗3組(D組)30 μmol/L、實驗4組(E組)40 μmol/L和實驗5組(F組)50 μmol/L。加入Aβ1-42并繼續培養72 h行以下檢測。

1.6 MTT法檢測 將待測的A組、B組、C組、D組、E組和F組分別加入不同濃度的Aβ1-42后繼續培養72 h，向每孔內加入濃度為5 mg/ml MTT液20 μl，調零孔內只加入維持培養液。繼續將其置于95%O2+5%CO2培養箱中培養3～4 h后以扣板法扣除孔內液體，隨后向各孔內加入DMSO150 μl，于37 ℃下震蕩溶解。待藍色結晶充分溶解后將96孔板置于酶標儀上，以570 nm的濾過波長測定各孔的光吸收值(OD值)。隨后通過測得的OD值計算各孔細胞的存活率，存活率的計算方法為以對照組作為參照，以細胞存活率(%)=實驗組OD值/對照組OD值×100%為公式進行計算。各設置3個平行組，最后取其均值進行統計學分析。

1.7 AD細胞模型的NSE免疫熒光檢測 阿爾茨海默細胞模型的NSE免疫熒光檢測的方法同原代海馬神經元細胞的NSE鑒定(詳見1.4)，完成上述步驟后在激光共聚焦顯微鏡下仔細觀察并記錄。

2 結 果

2.1 海馬神經元培養的形態學改變 將細胞種植在35 mm培養皿內后，于鏡下觀察發現原代海馬神經元細胞單個且均勻分布，形狀為原型，小而透亮；培養24 h后該細胞完全貼壁，部分細胞已經長出樹突；培養3 d時樹突長度約達到細胞胞體長度的3～4倍且細胞間已形成稀疏網絡，胞體形狀多呈現橢圓形或多角形，胞體體積較大且透光度高，可見其細胞核，核形圓且大；培養至5～7 d時細胞已生長成熟，樹突結構發達且相互之間形成致密網絡(見圖1)。

2.2 NSE免疫熒光檢測 將海馬神經元細胞培養7 d后經NSE免疫熒光檢測，激光共聚焦顯微鏡下觀察顯示突觸長度約達到細胞胞體長度的3～4倍，樹突結構發達且相互之間形成致密網絡，胞體形狀多呈現橢圓形或多角形，胞體體積較大；對于細胞核的染色顯示核形圓且大(見圖2)。

2.3 MTT檢測結果 加入Aβ1-42濃度為10 μmol/L的實驗1組細胞存活率為(98.55±1.42)%，與對照組相比P>0.05；加入20 μmol/L的實驗2組細胞存活率明顯下降為(90.37±3.25)%，與對照組相比P<0.05；加入30 μmol/L、40 μmol/L和50 μmol/L的實驗3、4和5組的細胞存活率顯著下降，分別為(66.34±2.76)%、(53.23±3.41)%和(41.55±2.37)%，與對照組相比P<0.01(見表1、圖3)。

表1 不同濃度Aβ1-42對海馬神經元細胞存活率影響的MTT檢測結果對比(%)

注：與對照組相比*P<0.05，具有統計學意義；**P<0.01，具有顯著統計學意義

A：培養3 d新生大鼠海馬神經元細胞(×200)；B：培養7 d新生大鼠海馬神經元細胞(×400)；C：典型海馬神經元細胞

A：免疫熒光技術檢測NSE在海馬神經元細胞細胞膜的分布(×400)，顏色為綠色；B：藍色為海馬神經元細胞細胞核的表達；C：A和B的融合

圖2 神經特異性烯醇化酶(NSE)在海馬神經元細胞的表達

圖3 不同濃度Aβ1-42對海馬神經元細胞存活率影響柱形圖對比

2.4 海馬神經元阿爾茨海默病細胞模型的NSE免疫熒光檢測結果 根據不同濃度Aβ1-42對海馬神經元細胞存活率影響的檢測，結果選擇加入Aβ1-42濃度為20 μmol/L的實驗2組為阿爾茨海默病細胞模型。對海馬神經元加入Aβ1-42繼續培養72 h建立阿爾茨海默病細胞模型后，進行NSE免疫熒光檢測后于激光共聚焦顯微鏡(×400)下觀察發現神經元細胞胞體存在變形、收縮和細胞膜完整性破壞等情況；由樹突形成的神經元細胞間網絡結構消失或斷裂且細胞外基質雜亂無序和不清，而且出現較多凋亡的神經元，細胞突起消失或斷裂(見圖4、圖5)。

A：免疫熒光技術檢測NSE在阿爾茨海默病細胞模型海馬神經元細胞細胞膜的分布(×400)，顏色為綠色；B：藍色為海馬神經元細胞細胞核的表達；C：A和B的融合

圖4 阿爾茨海默病細胞模型的NSE免疫熒光檢測結果

A：海馬神經元NSE免疫熒光技術檢測結果(×400)；B：阿爾茨海默病模型細胞NSE免疫熒光技術檢測結果(×400)

3 討 論

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種以認知功能進行性下降并與衰老相關聯的漸進性腦退行性疾病，其是由多種因素和途徑共同作用的結果[3]。Aβ蛋白相關假說在阿爾茨海默病研究領域中被認為是發病機制的主題，此假說認為過多Aβ蛋白的產生可引發興奮性毒性、氧化應激和細胞死亡等多種神經毒性的途徑[4]，但其增加興奮性神經遞質的程度還不得而知。有學者對阿爾茨海默病轉基因小鼠的研究發現在大腦的特定區域Aβ蛋白調節谷氨酸受體使谷氨酸能信號肽缺乏抵抗力，認知功能障礙也隨之出現[5]。Aβ的產生是由于β淀粉樣前體蛋白(APP)的代謝而來，是APP的正常代謝產物。APP是一種跨膜蛋白，由695～770個氨基酸組成，其在代謝后可產生39～43個氨基酸片段，其中由42～43個氨基酸組成的一種蛋白質片段被稱為Aβ1-42[6]。另外Aβ蛋白引發的奮性毒性、氧化應激和細胞死亡被認為是導致阿爾茨海默病患者腦組織神經元數量下降的重要因素[7]。因此應用Aβ蛋白誘導海馬神經元來建立阿爾茨海默病細胞模型可促進學者們從細胞分子學層面進一步研究阿爾茨海默病的發病機制和治療方法。

目前的對于阿爾茨海默病細胞模型建立的方法主要包括原代海馬神經元、神經嵴源細胞、神經膠質細胞、雜交組織細胞和基因工程細胞等為代表。大量的研究表明海馬神經元的大量凋亡與阿爾茨海默病患者認知功能障礙密切相關，同時原代海馬神經元的培養及Aβ蛋白誘導海馬神經元建立阿爾茨海默病細胞模型的方法具有經濟、適用、重復性高等特點，而且以Aβ1-42作為誘導蛋白與Aβ1-40相比具有神經毒性強和形成不溶性聚集體能力強等特點[8～10]。因而選擇Aβ1-42作為誘導蛋白建立阿爾茨海默病細胞模型更為理想。通過本次應用不同濃度Aβ1-42誘導海馬神經元建立阿爾茨海默病細胞模型的研究發現，隨著Aβ1-42濃度的增加神經元細胞的存活率也隨之下降，加入Aβ1-42濃度為10～50 μmol/L細胞存活率分別為(98.55±1.42)%、(90.37±3.25)%、(66.34±2.76)%、(53.23±3.41)%和(41.55±2.37)%。正常情況下原代海馬神經元體外培養細胞減少的主要方式包括主動性凋亡和繼發性壞死兩種[2]，而在本次研究中我們采用的對照組與實驗組細胞培養的條件及方式相同，進而相對的排除了主動性凋亡的干擾因素。實驗中隨著Aβ1-42濃度的增加至20 μmol/L時，細胞毒性開始增強，該組細胞死亡約10%，而且NSE免疫熒光檢測后于激光共聚焦顯微鏡下觀察發現神經元細胞胞體存在變形、收縮和細胞膜完整性破壞等情況，同時樹突形成的神經元細胞間網絡結構消失或斷裂，且細胞外基質雜亂無序并出現較多凋亡的神經元細胞。當濃度至30～50 μmol/L細胞死亡率達到約30%～60%，實驗結果提示Aβ1-42濃度所引起的細胞毒性過多，已不適合建模。綜合不同濃度Aβ1-42細胞存活率測定和細胞形態學改變等可斷定，當Aβ1-42濃度為20 μmol/L時誘導體外培養新生24 h內大鼠成熟海馬神經元細胞72 h可作為理想阿爾茨海默病細胞模型進行細胞分子生物學研究。

綜上所述，Aβ1-42誘導后的海馬神經細胞存活率下降，其中20 μmol/L誘導的SD大鼠海馬神經元作為理想的阿爾茨海默病細胞模型。應用本模型對阿爾茨海默病發病機制的研究提供理想平臺及載體，特別是在分子及細胞水平。

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A method for establishing a stable cellular model of Alzheimer’s disease

CAOFangyuan，LUODexin，HUANGYudiao.

(DepartmentofNeurology，the5thAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity，Daqing163319，China)

Objective Aimt to establish a stable model of Alzheimer’s disease by using different concentrations of Aβ1-42to induce hippocampal neurons of the primary culture for hippocampal neurons of SD newborn rats. Methods Extract and culture the primary hippocampal neurons from newborn SD rats within 24 h SD rats；Add to different concentrations of Aβ1-42to induce the hippocampal neurons and observe cell viability by method of MTT，then choose the ideal hippocampal neurons as Alzheimer’s disease cell model；Use the Immunofluorescence(IF)to identify the expression of neuron-specific enolase(NSE)in hippocampal neurons. Results The protein of Aβ1-42could lead to body deformation，shrinkage and cell membrane integrity damage of hippocampal neuron cell，network structure disappears or fracture between cells，clutter unclear of extracellular matrix and apoptosis of a large number of neurons；The survival rate of hippocampal neurons significantly reduced after induced by the protein of Aβ1-42and it had a liner relationship between the concentration of Aβ1-42，the cells of SD rats could as a kind of ideal model of Alzheimer’s disease cells. The survival rates of experimental groups were(98.55 ± 1.42)%，(90.37 ± 3.25)%，(66.34 ± 2.76)%，(53.23 ± 3.41)% and(41.55 ± 2.37)% by adding different concentrations of Aβ1-42. Conclusion The protein of Aβ1-42could lead to apoptosis of a large number of neurons；The hippocampal neurons of SD rats can as a kind of ideal model of Alzheimer’s disease cells，who the induce concentration of Aβ1-42is 20 μmol/L.

Alzheimer’s disease； Aβ1-42； Hippocampal neuron； Model

2016-11-20；

2017-02-11

(1.哈爾濱醫科大學基礎醫學院形態實驗中心，黑龍江 大慶 163319；2.哈爾濱醫科大學附屬第五醫院神經內科，黑龍江 大慶 163319)

黃玉雕，E-mail：41655579@qq.com

1003-2754(2017)03-0221-05

R749.1+6

A