肢體缺血預處理對腦缺血再灌注損傷大鼠自噬的影響

冷光朋， 劉開祥， 李 浩， 廖小明， 安 祥， 李 偲， 楊 陽

肢體缺血預處理對腦缺血再灌注損傷大鼠自噬的影響

冷光朋1， 劉開祥1， 李 浩1， 廖小明2， 安 祥1， 李 偲1， 楊 陽1

目的 探討肢體缺血預處理對腦缺血再灌注損傷大鼠自噬的影響。方法 將60只Wistar大鼠隨機分為假手術組(Sham組)、缺血再灌注組(I/R組)、肢體缺血預處理組(LIPC組)、3-甲基嘌呤組(3-MA組)，每組15只。制作腦缺血再灌注、肢體缺血預處理及3-MA干預大鼠模型，在腦缺血2 h再灌注24 h后進行神經功能缺陷評分和腦梗死體積測定，HE染色觀察細胞形態學改變，Western Bloting法檢測自噬相關蛋白Beclin-1、Cathepsin B的表達。 結果 與I/R組比較，LIPC組神經功能缺陷評分降低(P<0.05)，腦梗體積明顯減小(P<0.05)，細胞損傷、壞死減輕(P<0.05)，Beclin-1、Cathepsin B的蛋白表達明顯減弱(P<0.05)。結論 LIPC對缺血再灌注損傷大腦具有保護作用，其機制可能與減弱自噬水平有關。

腦缺血； 肢體缺血預處理； 自噬； Beclin-1； Cathepsin B

缺血性腦卒中是一種復雜的多因素疾病，傳統的恢復缺血區域的血流灌注，會導致缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，I/R)，在這種情況下，需要對新的神經保護措施進行探索。肢體缺血預處理(limb ischemic preconditioning，LIPC)，是指預先給予肢體反復短暫的缺血再灌注，激發機體的內源性保護機制，以提高組織耐受隨后持續較長時間缺血的能力，減輕臟器損傷的現象[1]。研究發現，LIPC對缺血再灌注損傷大腦有保護作用，但它的可能作用機制卻有待深入研究。

自噬(autophagy)是一種溶酶體參與的物質分解代謝過程，主要降解細胞內受損、變性或衰老的蛋白質，以胞質內出現自噬體為標志的細胞自我消化過程[2]。自噬作為一條重要的蛋白降解途徑，在I/R中參與的復雜調控機制已經成為神經系統疾病研究的熱點。本實驗通過建立大鼠腦缺血再灌注模型，觀察LIPC對損傷大腦自噬相關因子的影響，為進一步研究LIPC的作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康雄性Wistar大鼠，清潔級，共60只，體重(250±30)g，桂林醫學院動物實驗中心提供。術前12 h禁食，自由飲水。按隨機分組原則分成假手術組(Sham組)、缺血再灌注組(I/R組)、肢體缺血預處理組(LIPC組)、3-甲基嘌呤組(3-MA組)，每組大鼠15只。

1.2 主要試劑與儀器 兔抗鼠Beclin-1多克隆抗體、兔抗鼠Cathepsin B多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，鼠β-actin一抗、辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG、羊抗兔IgG(中杉金橋生物有限公司)，BCA試劑盒(碧云天生物科技公司)，3-甲基嘌呤組(Selleck生物科技有限公司)，雙極電凝器(廣州醫用電子儀器廠)，Western Bloting電泳設備(美國通用電氣公司)。

1.3 腦缺血再灌注模型的建立 I/R組、LIPC組、3-MA組參照Longa等方法制作局灶性腦缺血再灌注模型。鼠稱重，10%水合氯醛按0.30 ml/100 g腹腔注射麻醉，取仰臥位固定頭部及四肢，頸部備皮，碘伏消毒，酒精脫碘，取頸部正中部位切開皮膚，鈍性分離筋膜及肌肉，暴露左側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA)，蛙心夾夾閉CCA及ICA遠心端，結扎ECA遠心端，近心端掛線備用，血管剪于ECA上取一小口，插入石蠟線栓，備用的掛線打結固定線栓，血管剪離斷ECA遠心端。線栓從ECA逆行插向CCA分叉處，再將線栓轉至ICA，松開此處的蛙心夾，經ICA入顱感到有阻力為止，此時插入深度約為18 mm～20 mm，線栓頭部位于大腦中動脈起始部，松開CCA處的血管夾，縫合皮膚。缺血2 h時，抽提線栓實現再灌注。Sham組僅分離暴露血管，不做線栓處理。

1.4 遠隔缺血預處理模型的建立 腦缺血再灌注模型建立前30 min進行，在雙側后肢股部備皮，碘伏消毒，酒精脫碘，沿血管走行縱向切開皮膚、筋膜，鈍性分離股動脈，下方穿4-0手術絲線。通過上提絲線并用蛙心夾夾閉5 min，造成肢體缺血，松開蛙心夾，恢復血流灌注5 min，反復循環3次，實現對腦缺血再灌注損傷的肢體預處理操作。Sham組和I/R組僅分離暴露血管。

1.5 3-MA藥物干預 在缺血30 min前，3-MA組大鼠腹腔注射3-MA(15 mg/kg)，Sham組、I/R組、LIPC組注射與3-MA組相當的生理鹽水。

2 觀測指標及方法

2.1 神經功能缺陷評分 按照Longa等評分標準，各組均在再灌注24 h后進行評分。神經功能缺陷評分在1～3分為模型成功，0分和4分為模型不成功，予以剔除，在后續實驗中及時補充剔除出組的動物，保證每組動物數。

2.2 TTC染色 再灌注24 h后，各組隨機取5只大鼠迅速斷頭取腦。將腦組織置于-20 ℃冰箱冷凍20 min，冠狀位間隔2 mm連續切取5個腦片，置于2%的TTC溶液中，37 ℃水浴30 min，正常組織呈紅色，梗死區呈白色。染色后將腦組織置入4%多聚甲醛中固定，數碼相機拍照，將圖像輸入計算機，用Image-Pro Plus 5.1軟件進行圖像分析，根據公式計算腦梗死體積。

2.3 HE染色 各組隨機取5只大鼠，處死2 min內取腦組織，選取視交叉后1 mm至乳頭體之間的腦組織，冠狀位向后取2 mm厚度，4%多聚甲醛溶液固定腦組織，脫水，石蠟包埋，切片處理，HE染色，中性樹膠封固，光學顯微鏡下觀察組織細胞病理改變。

2.4 Western Bloting檢測Beclin-1、Cathepsin B的蛋白表達 各組隨機取5只大鼠，斷頭取腦，迅速分離腦梗死皮質部分，加入約5倍體積細胞裂解液，使用手持電動勻漿器將組織塊制備成組織勻漿，勻漿后冰上放置30 min，4 ℃、12.000 r/min，離心30 min，小心取上清。BCA法測定腦組織提取物的蛋白濃度后，等體積配平。根據目的蛋白的分子量，配制12% SDS-PAGE凝膠，上樣量20 μl/lane，80 V 60 min濃縮，160 V 80 min進行電泳分離。PVDF膜在無水乙醇里浸泡10 s后將海綿、濾紙、凝膠、PVDF膜一起放在轉膜緩沖液中浸泡3 min，按照海綿、濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙、海綿依次順序裝好轉膜裝置(膜靠紅色電極一邊)120 V 150 mA轉膜60 min。敷一抗，4℃過夜。15 ml TBST洗膜4次，每次8 min。敷二抗，室溫輕搖2 h。15 ml TBST洗膜4次，每次8 min，化學發光顯色。

3 結 果

3.1 神經功能缺陷評分結果 Sham組反應靈敏，無神經功能障礙，與Sham組比較，I/R組，LIPC組，3-MA組均出現程度不同的神經功能障礙(P<0.05)。與I/R組比較，LIPC組癥狀評分明顯降低(P<0.05)。LIPC組與3-MA組比較無顯著差異(P>0.05)(見表1)。

組別神經功能缺陷評分(分)n=15腦梗死體積(%)n=5Sham組I/R組LIPC組3?MA組02．40±0．737?1．80±0．862?#1．60±0．828#▽037．00±0．30?29．30±0．11?#16．67±0．50#▽

注：與Sham組比較*P<0.05，與I/R組比較#P<0.05，與LIPC組比較▽腦梗死體積P<0.05；神經功能缺陷評分P>0.05

3.2 腦梗死體積測定結果 TTC染色后，肉眼觀正常腦組織呈紅色，梗死區呈白色。與Sham組比較，I/R組，LIPC組，3-MA組均出現程度不同的腦梗死(P<0.05)，其中I/R組的梗死區面積最大。其中I/R組的梗死區面積最大。與I/R組比較，LIPC組腦梗體積顯著減小(P<0.05)；與LIPC組比較，3-MA組腦梗體積減小(P<0.05)(見表1、圖1)。

3.3 病理形態學觀察 HE染色后，經光學顯微鏡觀察，Sham組細胞形態正常，胞膜完整，核居中，胞質可見尼氏小體，無病理學改變。與Sham組比較，I/R組細胞呈急性缺血性改變，胞質為深紅染，細胞縮小變形，胞核固縮，胞質內尼氏小體消失(P<0.05)。與I/R組比較，LIPC組腦組織病理學改變明顯減輕(P<0.05)；與LIPC組比較，3-MA組細胞損傷減輕(P<0.05)(見圖2)。

3.4 腦缺血再灌注后各組自噬相關蛋白Beclin-1、Cathepsin B的表達 與Sham組比較，I/R組Beclin-1、Cathepsin B的蛋白表達明顯增強(P<0.05)；與I/R組比較，LIPC組Beclin-1、Cathepsin B的蛋白表達明顯減弱(P<0.05)；與LIPC組比較，3-MA組Beclin-1、Cathepsin B蛋白表達減弱(P<0.05)(見表2、圖3、圖4)。

圖1 TTC染色(A：Sham組；B：I/R組；C：LIPC組)

圖2 HE染色(×400：A：Sham組；B：I/R組；C：LIPC組；D：3-MA組)

圖3 Cathepsin B表達

圖4 Beclin-1表達

組別Beclin?1(n=5)CathepsinB(n=5)Sham組I/R組LIPC組3?MA組0．400±0．0461．526±0．297?1．000±0．030?#0．711±0．035#▽0．148±0．0510．799±0．136?0．595±0．089?#0．348±0．064#▽

注：與Sham組比較*P<0.05；與I/R組比較#P<0.05；與LIPC組比較▽P<0.05

4 討 論

腦缺血再灌注損傷已成為人類健康和生命的一大威脅，如何減輕再灌注損傷成為眾多學者研究的重點。有研究發現，LIPC對再灌注損傷器官的保護作用可能與改善微循環、維持和改善能量代謝、抑制炎性細胞的激活、減輕自由基產生、抑制細胞凋亡、誘導內源性保護物質的釋放等有關[3～5]。但是，LIPC對腦缺血再灌注損傷大腦自噬影響的研究報道較少。本試驗通過反復研究發現，I/R組的大鼠神經功能障礙評分及腦梗體積增大，細胞損傷嚴重，而LIPC對大腦有明顯的神經保護作用，表現為神經功能障礙評分降低，腦梗體積減小，細胞病理形態學改變減小，3-MA則能夠增強LIPC的腦保護作用。

生理狀態下，自噬在細胞內的水平較低，在營養缺乏或能量需求增高時，自噬過程被激活，對機體穩態的維持起著重要作用[6]。但是，過度的激活自噬，細胞器和蛋白質會被大量破壞而引起細胞死亡-Ⅱ型程序性細胞死亡，即非凋亡形式的程序性細胞死亡[7]，由此可見，自噬對組織細胞的作用具有兩面性。Cathepsin B是含量最豐富的溶酶體酶之一，其在自噬的降解過程中起重要作用[8]。本實驗對Cathepsin B的研究結果顯示，LIPC組Cathepsin B的蛋白表達較I/R組降低(P<0.05)，而3-MA組的蛋白表達更低(P<0.05)。Beclin-1是酵母Atg6的同源體，是哺乳動物一個特異性的自噬蛋白，可調控自噬體的生成，是細胞自噬啟動的標志基因，它的過度表達可以加速細胞自噬的發生，故其表達增強可作為自噬水平增強的重要指標[9]。本實驗發現較之Sham組，I/R組Beclin-1的蛋白表達亦呈明顯的升高趨勢(P<0.05)，與I/R組相比，LIPC組的蛋白表達降低(P<0.05)，與LIPC組相比，3-MA組的蛋白表達更低(P<0.05)。

本實驗通過建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型發現，I/R能夠激活自噬，造成腦組織的損傷，而LIPC可能通過逆轉自噬相關蛋白Beclin-1、Cathepsin B的過高表達，從而降低神經功能障礙評分，減小腦梗死體積和細胞形態學的病理損傷，自噬抑制劑3-MA能夠增強LIPC的腦保護作用。本研究通過觀察LIPC對腦缺血再灌注損傷后自噬的影響，并探討自噬在LIPC中對缺血腦組織的作用，為臨床上缺血性腦血管病的防治提供新思路和實驗依據。

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Influences of limb ischemic preconditioning on autophagy in rats with cerebral ischemia reperfusion injur.

LENGGuangpeng，LIUKaixiang，LIHao，etal.

(DepartementofNeurology，AffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity，Guilin541000，China)

Objective To study influences of limb ischemic preconditioning on autophagy in rats with cerebral ischemia reperfusion injure. Methods Sixty male Wistar rats were divided into sham operation group(Sham group)、cerebral ischemia reperfusion group(I/R group)、limb ischemic preconditioning group(LIPC group)、3-methlyadenine group(3-MA group)，15 rats in each group. Cerebral ischemia reperfusion，limb ischemic preconditioning and 3-MA intervention model were made，Neurological function deficit score and infarct volume determination were conducted after ischemia 2 h and reperfusion 24 h，HE staining was used to observe morphological changes of cell，the protein expression of Beclin-1、Cathepsin B were tested by Western blotting. Results Compared with I/R group，neurological function deficit score and infarct volume determination were reduced significantly(P<0.05)，the cell damage and necrosis were reduced(P<0.05)，the protein expression of Beclin-1、Cathepsin B decreased significantly(P<0.05). Conclusion LIPC has protective effects on ischemic reperfusion injury of the brain，probably through reduction of autophagy level.

Cerebral ischemia； Limb ischemic preconditioning； Autophagy； Beclin-1； Cathepsin B

2016-11-12；

2017-03-04

廣西省自然科學基金(No. 2012GXNSFAA053102)；廣西研究生教育創新計劃(No. YCSZ2014207)

(1.桂林醫學院附屬醫院神經內科，廣西 桂林 541000；2.桂林醫學院附屬第二醫院神經內科，廣西 桂林 541100)

劉開祥，E-mail：743192848@qq.com

1003-2754(2017)03-0234-04

R743.3

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