西瓜食酸菌TA基因酵母雙雜交誘餌載體的構建及其自激活作用的檢測

胡金鳳，黃成文，劉君

(1.新疆農業大學林學與園藝學院，烏魯木齊 830052；2. 新疆農業大學農學院，烏魯木齊 830052)

西瓜食酸菌TA基因酵母雙雜交誘餌載體的構建及其自激活作用的檢測

胡金鳳1，黃成文2，劉君1

(1.新疆農業大學林學與園藝學院，烏魯木齊 830052；2. 新疆農業大學農學院，烏魯木齊 830052)

【目的】構建西瓜食酸菌TA基因的酵母雙雜交誘餌載體，為探究TA基因編碼產物參與西瓜食酸菌致病的機制奠定基礎。【方法】通過PCR擴增TA基因，并定向克隆到載體pGBKT7，獲得可用于酵母雙雜交的誘餌載體pGBKT7-TA，經酶切鑒定和測序驗證為正確后將pGBKT7-TA轉化到酵母菌株AH109中；進一步用ADE2、HIS3、LacZ報告基因活性檢測法檢測pGBKT7-TA的自激活作用，用固體及液體營養缺陷型培養基培養法檢測pGBKT7-TA的毒性作用。【結果】誘餌載體pGBKT7-TA對酵母菌株AH109沒有自激活及毒性作用。【結論】所構建的誘餌載體可用于酵母雙雜交系統的后續工作，為進一步從被西瓜食酸菌侵染的黃瓜子葉cDNA文庫中篩選與TA互作的蛋白奠定了基礎。

西瓜食酸菌；TA基因；酵母雙雜交；誘餌載體

0 引 言

【研究意義】由西瓜食酸菌(Acidovoraxcitrulli，Ac)引起的細菌性果斑病(Bacterial Fruit Blotch，以下簡稱BFB)是一種可對葫蘆科植物造成毀滅性危害的病害[1-3]，自從1987年在美國的一些商品西瓜地自然爆發以來[4,5]，該病害已在全球傳播蔓延，并被發現也可導致甜瓜、籽瓜、南瓜、筍瓜以及黃瓜等其它葫蘆科植物發病[6-12]，細菌性果斑病目前已經成為全球葫蘆科作物產業的嚴重威脅[13]。迄今為止，世界范圍內針對BFB病菌致病的生物學和分子生物學基礎的認知非常有限，研究BFB病菌與寄主互作的分子機理，是開發有效控制BFB新途徑、新方法的基礎。TA基因是研究小組前期工作中篩選西瓜食酸菌Tn5轉座子插入突變體庫鑒定得到的，該基因缺失突變體在寄主植物上完全喪失致病力，在非寄主植物煙草(NicotianatabacumL.)上誘導過敏性壞死反應的能力也喪失，其基因功能注釋為編碼細菌新陳代謝途徑中的一個相對保守的酶，為該菌的致病必需因子，但目前未見有關于TA參與任何病菌致病作用機制的研究報道。酵母雙雜交系統 (Yeast two hybrid system) 最初是由Fields和Song[14]建立的用于檢測蛋白與蛋白相互作用的一種方法，它可以在活體酵母中探究蛋白質間的相互作用，并用于發現蛋白的新功能及新蛋白[15-18]。研究欲使用酵母雙雜交系統篩選與TA互作的蛋白，對探究西瓜食酸菌的致病機制具有重要意義。【前人研究進展】目前，利用酵母雙雜交系統探究蛋白質之間的相互作用已經發展成為一個成熟的研究手段，在眾多研究中得到應用。薛璞[19]構建了柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交cDNA文庫并且初步篩選了EtAMA1相互作用蛋白；林振[20]構建了乳鼠成骨細胞酵母雙雜交cDNA文庫并且篩選與CITED1相互作用蛋白；薩娜瓦爾·艾比布拉等[21]利用酵母雙雜交系統構建了擬南芥At4g05060基因的表達載體，并對其進行自激活檢測，篩選出與At4g05060基因互作的蛋白，從而為研究該基因的作用機制奠定基礎。【本研究切入點】迄今，BFB病菌致病機制的研究仍處于起步階段，TA參與西瓜食酸菌致病作用的發現為認識該菌致病的分子機制打開了一扇新的窗口。由于TA參與病菌致病未見相關報道，利用酵母雙雜交系統可以探尋與其互作的因子，構建有功能的酵母雙雜交誘餌載體成為必要條件。【擬解決的關鍵問題】研究構建的TA基因的酵母雙雜交誘餌表達載體在酵母菌株中應不存在自激活能力和毒性作用，這是下一步篩選與TA互作的蛋白、解析TA基因的作用機制的基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

西瓜食酸菌FC440野生型菌株為該實驗室保存，大腸桿菌(E.coli)化學感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司，酵母菌株AH109、表達載體pGBKT7，對照質粒pGBKT7-53、pGBKT7-Lam、pGADT7-T購自上海北諾生物公司，細菌基因組提取試劑盒購自天根(Tiangen Biotech Inc.)，PCR試劑、限制性內切酶、T4DNA連接酶等為TaKaRa產品，DNA質粒提取試劑盒及DNA凝膠回收試劑盒為Axygen產品，酵母缺陷型培養基、50%PEG3350、Yeastmaker Carrier DNA、二甲基亞砜(DMSO)等為Sigma產品。引物合成及測序由華大 (Beijing Genomics Institute)公司完成。

1.2 方 法

1.2.1TA基因的克隆

根據pGBKT7載體上的多克隆位點，用Primer Premier 5設計特異引物序列對，TA-F：5‘-3’ CGCGGATCCGATCCGATGCACGACTTC，TA-R：5’-3’ ACGCGTCGACTCAGCCCCGGAATTCCTC，下劃線部分分別表示BamHⅠ和SalⅠ酶切位點。以野生型FC440的基因組DNA為模板，使用高保真的PrimerSTARTMHS DNA polymerase擴增大小約為1 072 bp含TA基因的片段。PCR反應體系為：5×Primer STARTMbuffer (Mg2+)4 μL，dNTPs(2.5 mmol/L) 1.6 μL，TA-F (10 μmol/L)1.0 μL，TA-R (10 μmol/L) 1.0 μL，FC440 DNA(30ng/L) 1.0 μL，Primer STARTMHS DNA polymerase (2.5 U/L) 0.2 μL，ddH2O 11.2 μL 。PCR反應條件為：95℃變性5 min；98℃變性10s，68℃退火2 min，共30個循環；最后72℃延伸5 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用DNA凝膠回收試劑盒切膠回收目的片段。

1.2.2 酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-TA的構建

將PCR擴增的目的基因TA、載體PGBKT7分別用BamHⅠ和SalⅠ進行雙酶切，用DNA凝膠回收試劑盒回收純化目的片段與載體片段，經T4DNA連接酶16℃過夜連接，產物經熱激法轉化進E.coli大腸桿菌感受態細胞中，用含50 μg/mL Kan的LB平板篩選轉化子，提取轉化子的質粒用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定，將鑒定呈陽性的質粒測序，序列正確的質粒即為誘餌載體pGBKT7-TA。

1.2.3 酵母感受態細胞的制備

取保存于-80℃的AH109酵母菌株，劃線接種至YPDA固體平板上，30℃培養3～4 d，從YPDA固體平板上挑取直徑2～3 mm的單克隆，接種于30 mL YPDA液體培養基中，30℃，200 r/min，過夜培養；將過夜培養的菌液稀釋至100 mL 新鮮的YPDA 液體培養基中，直至 OD600約為 0.2～0.3，200 r/mim 30℃搖菌至OD600為0.4～0.6(約3 h)；1 000×g室溫離心5 min，棄上清；用約 25～50 mL 無菌水重懸細胞，1 000×g離心5 min，棄上清；重復洗滌一次；沉淀用1.5 mL 新鮮配制的1×TE/LiAc重懸，即獲得酵母感受態細胞。

1.2.4 酵母感受態細胞的轉化

按照表1中分組分別于1.5 mL無菌離心管中加入200 ng待轉化質粒和0.1 mg Carrier DNA(10 mg/mL)(新配置時水浴煮沸20 min，立即插入冰浴，保存于-20℃，每次使用前煮沸5 min，立即置于冰上備用)，再加入 100 μL新制備的酵母感受態細胞AH109，震蕩混勻；各加入 600 μL PEG/LiAc溶液，劇烈振蕩(提高轉化效率)，30℃，200 r/mim 振蕩培養30 min，中間每隔10 min顛倒混勻一下；各加入 70 μL DMSO，緩緩倒置混勻(不能振蕩)，42℃水浴熱休克15 min，每隔5 min混勻一次，立即置于冰浴冷卻1～2 min；于室溫12 000×g離心15s，盡量棄盡上清，以500 μL 1×TE 重懸沉淀細胞，分別取100 μL涂布于相應的缺陷型固體平板，30℃倒置培養3～5 d，觀察酵母菌落的生長情況。表1

表1 酵母轉化分組
Table 1 The groups of Yeast Transform

反應ReactionAD質粒ADplasmidBD質粒BDplasmid涂板種類Typesofcoating備注Remarks1pGADT7-TpGBKT7-53SD-TL陽性對照2pGADT7-TpGBKT7-lamSD-TL陰性對照3pGADT7pGBKT7-TASD-TL自激活檢測4-pGBKT7-TASD-T篩庫備用

1.2.5 誘餌載體pGBKT7-TA轉化AH109酵母菌

將誘餌質粒pGBKT7-TA轉化進酵母菌AH109，涂布于SD/-T缺陷型固體平板上，30℃培養3～5 d，觀察菌落生長情況。再隨機挑選克隆做菌落PCR鑒定，PCR反應體系中MgCl2、dNTP 終濃度分別為2 mmol/L和200 μmol/L，引物TA-F/TA-R(10 μM)終濃度為500 μmol/L，Taq酶(TaKaRa)2.5 U。PCR反應條件為：95℃預變性5 min；95℃變性 30s，57℃ 退火30s，72℃ 延伸30s，共35個循環；最后72℃延伸10 min。用0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，驗證誘餌質粒轉化到酵母菌AH109的成功與否。

1.2.6 誘餌載體pGBKT7-TA的自激活檢測

pGBKT7-TA與pGADT7共轉化AH109長出的酵母轉化子隨機挑取了6個菌落進行自激活檢測。HIS3和ADE2報告基因的檢測采用點板培養的方法，將轉化子點板至SD-TLHA平板，30℃恒溫培養4 d，觀察其生長狀態。LacZ報告基因的檢測，從轉化平板隨機挑取6個菌落于濾紙片上；將濾紙完全浸于液氮中90s，取出常溫放置2 min晾干；在培養皿中加入新鮮配制的顯色液，一般9 cm培養皿用2～3 mL顯色液，將顯色液加入培養皿中，再放入一張干凈的濾紙，讓其完全浸濕；將凍溶后的濾紙放在最上面，使顯色液浸透表層，蓋上皿蓋；30℃避光培養，20 min后開始觀察，一般2 h后可開始看到顏色變化，4～5 h拍照記錄結果。自激活檢測組的生長情況同陰性對照，就說明其無激活作用。

1.2.7 誘餌載體pGBKT7-TA的毒性檢測

將誘餌載體pGBKT7-TA和空質粒pGBKT7分別轉化至酵母菌AH109中，方法同1.2.4。觀察二者在SD/ -T選擇培養基上的菌落生長的快慢及數量，來判斷誘餌蛋白是否有毒性。待菌落長出后，分別從兩組平板上挑取單個菌落重懸于50 mL SD/ -T液體培養基中30°C、250 r/mim振蕩培養18 h，通過比較pGBKT7-TA轉化子和pGBKT7轉化子菌液OD600值，可進一步判斷誘餌質粒pGBKT7-TA對酵母菌AH109是否有毒性。

2 結果與分析

2.1 誘餌載體pGBKT7-TA的構建

以野生型FC440的基因組DNA為模板，采用高保真的DNA聚合酶擴增目的基因TA，PCR產物經電泳檢測，結果顯示擴增得到1 072 bp左右的TA片段，與預期目標大小一致，表明成功擴增到TA基因。圖1

MⅢ：MarkerⅢ 1：TA基因PCR產物

MⅢ：MarkerⅢ 1：amplicon

圖1TA基因PCR擴增
Fig.1 PCR amplification ofTAgene

載體pGBKT7與TA基因片段連接后獲得的候選重組子用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后經瓊脂糖凝膠電泳分析，得到的酶切片段大小與預期片段大小一致，測序結果也表明與目的基因序列完全一致，表明酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-TA構建成功。圖2

M1：1kb DNA Ladder；M2：MarkerⅢ；1：誘餌質粒PGBKT7-TA酶切產物

M1：1kb DNA Ladder；M2：MarkerⅢ；1：pGBKT7-TAdigested withBamHⅠandSalⅠ

圖2 誘餌質粒pGBKT7-TA的酶切鑒定

Fig.2 Identification of pGBKT7-TAby restriction enzyme digestion

2.2 誘餌質粒pGBKT7-TA轉化AH109酵母菌

將誘餌質粒pGBKT7-TA轉化進酵母菌株AH109中，涂布于SD/-T缺陷型固體平板上，30℃培養3～5 d后有粉色菌落長出，隨機挑選克隆做菌落PCR鑒定,擴增得到1 072左右的片段，與預期片段大小一致。結果說明誘餌質粒pGBKT7-TA成功轉化進AH109酵母菌中。圖3

M1：1kb DNA Ladder；1：AH109(pGBKT7-TA)

圖3 誘餌質粒pGBKT7-TA轉進酵母菌AH109的鑒定

Fig.3 Identification of pGBKT7-TAtransformed in yeast strain AH109

2.3 誘餌載體pGBKT7-TA的自激活檢測

將自激活檢測組、陽性對照、陰性對照轉化進AH109酵母感受態細胞培養3～5 d后，再采用點板培養的方法檢測ADE2和HIS3報告基因，結果顯示三組菌株在SD/-TL缺陷平板上均能正常生長，在SD/-TLHA缺陷平板上僅有陽性對照生長，pGBKT7-TA/pGADT7轉化子中隨機挑選的5個菌落在SD/-TLHA缺陷平板上不能生長，同陰性對照生長狀態相同，LacZ檢測中結果顯示結果也與陰性對照相同，這說明重組質粒pGBKT7-TA無自激活作用，可用于后續實驗。圖4

陽性對照：pGBKT7-53/pGADT7-T；陰性對照：pGBKT7-lam/pGADT7-T

Positive control: pGBKT7-53/pGADT7-T Negative control: pGBKT7-lam/pGADT7-T

圖4 誘餌質粒pGBKT7-TA對報告基因的自激活檢測
Fig.4 Analysis of self-activation of the bait vector pGBKT7-TA

2.4 誘餌載體pGBKT7-TA的毒性檢測

研究表明，誘餌質粒pGBKT7-TA和空質粒pGBKT7轉化進酵母菌中，于SD/-T缺陷型固體平板上長勢良好數量大致相同，且菌落直徑大多都大于2 mm。AH109(pGBKT7-TA)和AH109(pGBKT7)分別接種于50 mL SD/-T缺陷型液體培養基中，30℃培養18 h后，測得OD600分別為1.636和1.643，均大于0.8 。結果表明，誘餌載體pGBKT7-TA對酵母菌株AH109沒有毒性作用。圖5

圖5 誘餌質粒pGBKT7-TA對酵母菌AH109的毒性檢測
Fig.5 Analysis of toxicity of pGBKT7-TAto yeast strain AH109

3 討 論

BFB作為先后被列入《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》和《全國農業植物檢疫性有害生物名單》一種檢疫性細菌病害，對葫蘆科作物的生產造成的損失是巨大的。因此，科學的認識細菌性果斑病菌致病機理成為有效防控病害傳播的關鍵。目前針對BFB病原菌參與寄主致病機制方面已有一些研究報道，陳濤等[22]驗證了瓜類細菌性果斑病中具有細菌群體感應調節系統，將降解細菌信號分子的基因aiiA導入瓜類細菌性果斑病菌中，降低了信號分子的產生，并使該菌株的致病性降低；Johnson[23]研究發現T2SS減弱了病菌的定殖能力和從種子到幼苗的傳播能力；劉君[24]研究發現非鞭毛Ⅲ分泌系統ATPase蛋白為西瓜食酸菌的致病必需因子；王建超等[25]研究表明，西瓜食酸菌鞭毛的形成與吡哆醛磷酸(VB6)的生物合成有關；王敏鑫等[26]研究表明pilQ基因是Ⅳ型菌毛的功能基因且能參與合成西瓜食酸菌Ⅳ型菌毛，同時證實西瓜食酸菌的顫動性、致病性、游動性及生物膜的形成與Ⅳ型菌毛有密切關聯。上述研究發現的存在于西瓜食酸菌中參與致病的因子：群體感應系統(quorum sensing, QS)、Ⅱ型分泌系統(T2SS)和Ⅲ型分泌系統(T3SS)、鞭毛、菌毛等，均是已經證實的存在于細菌中的致病因子(系統)。一些研究也發現在病原細菌新陳代謝中的酶也會參與致病過程，例如，結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)中參與脂肪酸代謝的異檸檬酸裂解酶(Isocitrate lyase)ILC1 和ILC2同時為該菌的毒性所必需，二者的缺失菌株完全喪失致病性[27]；Schmid等[28]證實在致病性耶爾森氏菌(Yersiniaenterocolitic)中參與T3SS效應物蛋白表達調節的功能調節子YscM1和YscM2也調控該菌的中央代謝，二者的缺失顯著改變菌的一些代謝活動，且均可以與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPC)互作，體外實驗證實YscM1顯著地抑制PEPC的活性。研究中的TA基因功能注釋為西瓜食酸菌代謝途徑中一個相對保守的酶，目前其參與西瓜食酸菌的致病性的功能尚未見研究報道。TA蛋白為一個依賴5'-磷酸吡哆醛輔因子的酶。已有研究報道表明，多個被批準的藥物靶標是5'-磷酸吡哆醛依賴型的代謝酶，如DOPA 脫羧酶(參與帕金森病)、GABA氨基轉移酶等，另有二十多個被識別的潛在藥物靶標或除草劑靶標均為5'-磷酸吡哆醛依賴型酶[29]。認為西瓜食酸菌中的TA蛋白可以作為殺菌劑的靶標而能夠開發出防控BFB的有效措施。

目前，研究蛋白質間相互作用的方法很多，例如酵母雙雜交技術、免疫共沉淀、GST pull-down技術、Western blot技術、噬菌體展示技術等等，其中酵母雙雜交技術敏感度極高，能省略純化蛋白質的繁瑣步驟檢測到一些微弱或短暫的蛋白質之間的相互作用，并且能在活體酵母細胞中進行，且不受外界環境條件的影響，在一定程度上代表細胞內的真實水平，這是其他離體生化檢驗方法所達不到的[30]。但酵母雙雜交技術也存在一定的局限性，首要問題就是報告基因的自激活造成的假陽性[31,32]，如若所構建的誘餌表達載體存在自激活作用，將會對后續的篩選工作造成嚴重影響。研究構建了西瓜食酸菌TA基因的酵母雙雜交誘餌載體，并對其進行了自激活和毒性作用的檢測。自激活實驗結果證實誘餌質粒對報告基因沒有自激活作用，排除假陽性的影響；毒性作用實驗證實誘餌質粒對酵母菌株AH109沒有毒性作用，酵母菌能正常生長。誘餌載體構建是成功的，為進一步利用酵母雙雜交系統篩選TA蛋白的互作蛋白奠定了基礎。

4 結 論

研究構建的酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-TA，通過檢測AH109(pGBKT7-TA/pGADT7)中報告基因ADE2、HIS3、LacZ的活性，并對比AH109(pGBKT7-TA) 、AH109(pGBKT7)在固體及液體營養缺陷型培養基中的生長狀況。誘餌載體pGBKT7-TA對酵母菌株AH109無自激活及毒性作用，該誘餌載體可用于酵母雙雜交系統中篩選與TA蛋白相互作用的蛋白質，為研究BFB菌致病機制奠定了基礎。

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Supported by:The National Natural Science Foundation of China"Genetic and molecular characterization of a novel pathogenicity gene inAcidovoraxcitrulli" (31260419)

Construction and Self-activation Detection of Bait Vector for Yeast Two-hybrid System ofTAgene inAcidovoraxcitrulli

HU Jin-feng1, HUANG Cheng-wen2, LIU Jun1

(1.CollegeofForestryandHorticulture,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China;2.CollegeofAgronomy,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China)

【Objective】 This project aims to construct a bait vector for yeast two-hybrid system ofTAgene inAcidovoraxcitrulliin order to lay the foundation for exploring the gene function involved in the pathogenic mechanism.【Method】TheTAgene was amplified by PCR and cloned into the vector pGBKT7. The verified pGBKT7-TAwas then transformed into the yeast strain AH109. The activities of report genesADE2,HIS3 andLacZwere used to detect the self activation of pGBKT7-TA, and the toxicity of pGBKT7-TAwas investigated in nutrient deficient medium.【Result】The constructed bait vector pGBKT7-TAhad neither self-activation nor toxic effect in the yeast strain AH109.【Conclusion】The constructed bait vector can be used for the follow-up work of the yeast two hybrid system, which has laid a foundation for further screening of proteins interacting with TA from the cDNA library of cucumber cotyledons infected byAcidovoraxcitrulli.

Acidovoraxcitrulli;TAgene; yeast two-hybrid system; bait vector

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.02.011

2016-12-05

國家自然科學基金項目“細菌性果斑病菌(Acidovoraxcitrulli)一個新型致病基因的作用機制研究”(31260419)

胡金鳳(1990-)，女，重慶銅梁人，碩士研究生，研究方向為分子生物學，(E-mail)hujinfeng137@126.com

劉君(1970-)，女，湖北麻城人，副教授，研究方向為植物病原細菌致病機制，(E-mail)liujem@126.com

S188

A

1001-4330(2017)02-0289-08