人工栽培鐵皮石斛及其市售干品品質比較與HPLC指紋圖譜分析

李杰，何梅，王再花*

(1.廣東省農業科學院環境園藝研究所/廣東省園林花卉種質創新綜合利用重點實驗室，廣東廣州510640;2.華南師范大學生命科學學院/廣東省植物發育生物工程重點實驗室，廣東廣州510631)

人工栽培鐵皮石斛及其市售干品品質比較與HPLC指紋圖譜分析

李杰1，何梅2，王再花1*

(1.廣東省農業科學院環境園藝研究所/廣東省園林花卉種質創新綜合利用重點實驗室，廣東廣州510640;2.華南師范大學生命科學學院/廣東省植物發育生物工程重點實驗室，廣東廣州510631)

比較不同產地鐵皮石斛品質差異，建立HPLC指紋圖譜，對其質量控制提供參考。以29份來自云南、浙江、湖南、廣西和廣東不同栽培產地的鐵皮石斛(25份鮮條、4份市售干條和楓斗)為試材，比較了其多糖和醇溶性浸出物含量，并利用HPLC法建立了鐵皮石斛指紋圖譜。結果表明，樣品間多糖含量和醇溶性浸出物含量差異顯著，有1份樣品的多糖含量和4份樣品的醇溶性浸出物含量未達到中國藥典的標準。HPLC指紋圖譜分析發現29份樣品共有13個共有峰，除1份云南樣品與對照圖譜的相似度為0.676外，其余樣品與對照圖譜相似度均在0.751～0.934。依據共有峰峰面積聚類分析發現僅少數來源地相近的鐵皮石斛樣品能優先聚類，而多糖含量、醇溶性浸出物含量與相似度間并沒有明顯的相關性。不同產地的人工栽培鐵皮石斛及其市售干品品質差異較大，鐵皮石斛HPLC指紋圖譜含13個共有峰，利用該圖譜可以對鐵皮石斛進行質量評價。

鐵皮石斛;多糖;醇溶性浸出物;HPLC指紋圖譜

鐵皮石斛(Dendrobium officinale)是蘭科石斛屬的多年生草本植物，我國傳統的名貴中藥材，富含多糖、氨基酸和微量元素等多種化學成分，具有有健脾養胃、滋陰補腎、潤肺生津等功效［1－3］，現代藥理研究也證明，鐵皮石斛還具有增強機體的免疫能力［4］、抗氧化［5－6］、抗腫瘤［7］、降低血糖［6，8］、鎮痛消炎［9］等作用，藥用保健價值高。目前鐵皮石斛在秦嶺淮河以南的諸多省區都有分布和栽培，云南和浙江的栽培面積較大，而由于產地、生態環境和栽培管理的不同，產品質量和化學成分也存在差異，2010年版《中國藥典》就對其多糖和醇溶性浸出物含量提出了明確要求［10］。為有效地比較和控制鐵皮石斛產品質量，鄧星燕等［11］建立了利用紫外光譜快速鑒別云南省不同產地鐵皮石斛的方法，何鐵光等［12］分析了廣西省內13份鐵皮石斛新鮮莖的HPLC指紋圖譜，而劉文杰等［13］和崔娟等［14］則主要分析了云南省內不同產地鐵皮石斛新鮮莖的HPLC指紋圖譜分析，而有關湖南、廣東等地栽培的鐵皮石斛以及市售鐵皮石斛干條和楓斗的報道甚少。本研究參考《中國藥典》標準，同時比較測定了25份來自云南、浙江、湖南、廣西和廣東不同來源的鐵皮石斛新鮮莖以及4份市售干條和楓斗樣品的多糖和醇溶性浸出物成分含量，并利用HPLC指紋圖譜法進行了比較研究。比較不同來源的人工栽培鐵皮石斛及其市售干品品質，建立HPLC指紋圖譜，并對其品質進行比較評價，以期對鐵皮石斛質量現狀和質量控制提供參考。

表1 鐵皮石斛編號及其來源Table 1 Numbers and locations of Dendrobium officinale samples

1 材料與方法

1.1 供試材料

采集于不同地點的人工栽培鐵皮石斛新鮮莖25份、市售鐵皮石斛干條2份和鐵皮楓斗2份，共29份樣品，60℃烘干，粉碎過60目篩，置干燥器中備用。樣品編號及其來源具體見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 HPLC供試樣品液制備精密稱取鐵皮石斛粉末l g于磨口三角瓶中，適量10%氨水潤濕，加入甲醇50mL并密閉靜置30 min，于85℃下水浴回流提取4 h，趁熱過濾，濾液于65℃下旋轉蒸發至干后，用5 mL甲醇溶解并定容，過膜過濾得到供試溶液，每樣品提取3次作為3個重復。

1.2.2 HPLC色譜分析條件儀器為Aglient1100高效液相色譜儀配紫外檢測器和自動進樣器，色譜柱:C18液相色譜柱250 mm×4.6 mm，5μm。流動相:乙腈(A)～0.1%磷酸(B)，A+B=100;梯度洗脫A的濃度變化為0～10 min，10%;10～20 min，15%;20～30 min，20%;30～40 min，20%;40～55 min，25%;55～60 min，10%;60～67 min，10%。流速:1.00 mL/min，紫外檢測器波長為310 nm，進樣體積:20μl。

1.2.3 多糖含量與醇溶性浸出物含量測定多糖參考《中國藥典》2010年版的方法進行測定分析［10］，每份樣品測定3次，取其平均值。醇溶性浸出物含量照《中國藥典》2010年版一部附錄XA項下熱浸法測定［10］，用乙醇做溶劑，每份樣品測定3次，取其平均值。

1.2.4 數據分析數據利用SAS進行方差分析和聚類分析，指紋圖譜數據應用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(《國家藥典委員會》2004A版)軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 鐵皮石斛共有峰的標定與對照指紋圖譜的生成

運用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”2004A版軟件對不同來源的29份鐵皮石斛樣品HPLC指紋圖譜進行多點校正，再進行相似度分析和匹配分析，并匹配后生成對照指紋圖譜。從圖1可以看出，29份樣品共有13個共有峰，其中11和12號峰的峰面積相對大些。

2.2 相似度比較

利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”2004A版軟件，計算不同產地的29份鐵皮石斛樣品間指紋圖譜的相似度和與對照指紋圖譜的相似度(表2)。各產地樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度在0.676～0.934，除S15樣品的相似度略低外，其余樣品的相似度均在0.75以上，其中10個樣品的相似度達在0.90以上，相似度較好。

2.3 不同來源鐵皮石斛多糖和醇溶性浸出物含量比較

圖1 29份鐵皮石斛樣品指紋圖譜的匹配分析Fig.1 Fingerprintsmatching analysis of 29 Dendrobium officinale

表2 29份鐵皮石斛的多糖含量、醇溶性浸出物含量與相似度Table 2 Polysaccharide content，alcohol soluble extract content and similarity of29 Dendrobium officinale samples

由表2可以看出，鐵皮石斛的2種主要成分存在較大差異。29份樣品中，18份樣品的多糖含量超過40.0%，其中S16的多糖含量最高，為55%，顯著高于其他樣品，而S17、S18和S20次之，三者的多糖含量也達到了44%以上，而S15最低，僅24.3 %。醇溶性浸出物方方面，有13份樣品均超過10.0%，最高為S25，達27.2%，顯著高于其他樣品，而S29最低，顯著低于其他樣品。參考2010版《中國藥典》的標準，鐵皮石斛多糖含量不得少于25.0 %，醇溶性浸出物含量不得少于6.5%，本研究中的29份樣品多糖含量僅S15低于該標準，多糖含量達標率為96.6%，而S2、S20、S22和S29 4份樣品(包含1份市售干條和1份楓斗)的醇溶性浸出物含量低于該標準，醇溶性浸出物含量達標率為86.2 %。

2.4 聚類分析

HPLC指紋圖譜反映了鐵皮石斛中的大部分化學成分信息，而峰面積的大小則表明化學成分含量的高低。將29份樣品的13個共有峰峰面積利用SAS軟件進行聚類分析，其結果如圖2所示。29份樣品聚為3類，S4、S14和S21為第1類群，其中S4和S14都來自廣西都嶠山，而S21為浙江藥店。S3、S10和S18為第2類群，其余樣品為第3類群。在第3類群中，S9、S11和S12均來自廣西，且先聚在一起。S5、S26、S13和S7先聚在了一起，四者均來自云南。S20、S22和S23也優先聚在了一起，其中S20和S23均來自廣州清平市場，說明這些來源地相近的鐵皮石斛其化學成分含量相似，但其他多數樣品未見明顯的規律。

圖2 不同產地鐵皮石斛聚類分析圖Fig.2 Clustering analysis of Dendrobiumofficinale produced from different areas

3 討論

因氣候條件和栽培技術的不同，不同地域栽培的鐵皮石斛主要化合物成分含量存在顯著差異，俞巧仙等［15］研究了鐵皮石斛多糖和醇溶性浸出物含量的動態變化規律，證實當以多糖與醇溶性浸出物總量為目標時以春芽萌動至開花前采收為宜，本研究中樣品于12月份采收，與其時期一致。諸燕等［16］研究發現浙江省內不同產地的13份2年生鐵皮石斛的多糖含量在25.63%～41.65%，而劉文杰等［13］也發現云南省內不同產地的6份鐵皮石斛多糖含量在30.63%～35.87%，而醇溶性浸出物含量在7.92%～13.65%，且以勐海栽培的含量最高。本研究進一步擴大了樣品數及其栽培范圍，發現鐵皮石斛的差異更大，29份樣品的多糖含量在24.3%～55%，多糖含量高于40%的樣品主要來至浙江、廣西和廣東產地，而低于30%的樣品則廣西、云南和浙江產地均有。29份樣品的醇溶性浸出物含量在4.0%～27.2%，含量較高的幾份樣品來自云南、浙江和廣西。2份湖南樣品的這2個指標基本處于中等水平。對4份市售鐵皮石斛干品和楓斗的比較發現，多糖含量均符合《中國藥典》的標準，且3份含量在40%以上，但醇溶性浸出物含量則有2份未達到《中國藥典》6.5%的標準［10］，因此，基于對市售鐵皮石斛質量的監管，醇溶性浸出物含量的檢測顯得更為重要。

HPLC指紋圖譜的直觀比較，能夠反映各化學成分的有無和含量高低，從而判斷樣品的一致性情況。何鐵光等［12］分析13份廣西栽培的鐵皮石斛，有12份相似度均在0.7以上，1份僅為0.604;劉文杰等［13］發現6份云南栽培的鐵皮石斛相似度在0.8以上。本研究中來自5個不同栽培省份的29份鐵皮石斛共找到13個共有峰，其中28份樣品的相似度在0.75以上，而4份楓斗和干品的相似度在0.751～0.914，說明鐵皮石斛鮮條、干條和楓斗的品質都存在差異。樣品S15相似度最低(0.604)，該樣品的多糖含量也最低(24.3%)，而將所有樣品的多糖含量、醇溶性浸出物含量以及與對照指紋圖譜的相似度進行分析，未見明顯的相關性。

4 結論

不同產地的29份人工栽培鐵皮石斛及其市售干品在多糖含量和醇溶性浸出物含量上差異顯著，基于上述樣品構建的鐵皮石斛HPLC指紋圖譜含13個共有峰，利用該圖譜可以對鐵皮石斛進行質量評價。

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(責任編輯 陳虹)

Quality Com parison and HPLC Fingerprints Analysis of Cultivated Dendrobium officinale and Its Dried Commodities

LI Jie1，HE Mei2，WANG Zai-hua1*
(1.Environmental Horticulture Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Lab of Ornamental PlantGermplasm Innovation and Utilization，Guangdong Guangzhou 510640，China;2.College of Life Science，South China Normal University/Guangdong Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development，Guangdong Guangzhou 510631，China)

Comparing the quality differences of Dendrobium officinale from different areasand establishing the HPLC fingerprintsof D.officinale were conducted to provide a reference for quality control.The polysaccharide contentand alcohol soluble extract content of29 D.officinale(25 fresh samples and 4 dried samples and Fengdou)from different cultivation areaswere evaluated，and their fingerprintswere established using HPLCmethod.The results showed that29 sampleshave significant differences in the contentofpolysaccharidesand alcoholsoluble extracts，butpolysaccharide contentof one sample and alcoholsoluble extractcontentof four sampleswere below the standardsof the Chinese pharmacopoeia.HPLC fingerprints indicated therewere13 common peaks among29 samples.The similarity of HPLC fingerprintsof D.officinale was higher(between 0.751 and 0.934)except one Yunnan sample was0.676.Clustering analysis indicated a few D.officinale with similar sourceswere priority clustering，and no correlation was found among the polysaccharide content，alcohol soluble extract content and similarity.The qualitieswere diverse among the D.officinale samples from different areas.HPLC fingerprints of D.officinale contained 13 common peaks，which could be used for quality evaluation of D.officinale.

Dendrobium officinale;Polysaccharides;Alcohol soluble extract;HPLC fingerprints

S567

A

1001－4829(2017)2－0262－05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.2.004

2016－03－20

廣東省科技計劃項目(2013B090600147和2013B0 20302011);國家青年基金項目(31400597)

李杰(1983－)，男，湖南常德人，博士，助理研究員，研究方向為植物栽培生理與遺傳育種，*為通訊作者，E-mail:wangzaihua@163.com。