川渝黔稻瘟病菌毒性的區域分化研究

張姝，鐘雪蓮，喬貴艷，沈麗，周天云，彭云良*

(1.四川省農業科學院植物保護研究所/農業部西南作物有害生物綜合治理重點實驗室，四川成都610066;2.四川省農業廳植物保護站，四川成都610042;3.重慶市種子管理站，重慶401121)

川渝黔稻瘟病菌毒性的區域分化研究

張姝1，鐘雪蓮1，喬貴艷1，沈麗2，周天云3，彭云良1*

(1.四川省農業科學院植物保護研究所/農業部西南作物有害生物綜合治理重點實驗室，四川成都610066;2.四川省農業廳植物保護站，四川成都610042;3.重慶市種子管理站，重慶401121)

四川、重慶和貴州是我國稻瘟病(Magnaporthe oryzae)重要發生區之一，分析這些地區稻瘟病菌群體的毒性差異，有助于延長抗性品種使用壽命，減輕稻瘟病發生危害。為了解不同地區稻瘟病菌的毒性差異，2012－2013年在四川、重慶21個縣(區)的稻瘟病常發地種植以麗江新團黑谷為背景的24個水稻抗稻瘟病單基因系，按國際水稻所0～9級標準調查各地水稻抗稻瘟單基因系的發病情況。2014－2015年采集四川省北部10個、貴州省全境15個和山東省2個縣(區)共47塊病田穗頸瘟標樣，浸濕后接種上述近等基因系及16個水稻品種并以薄膜覆蓋隔離40 d后調查。四川、重慶21個病圃的調查結果表明在不同地點表現抗病的頻率最高的基因為Pi2(38.10%)。四川、貴州等地標樣接種鑒定結果表明Pikh、Piks和PiKm對來自貴州28塊病田的稻瘟菌的抗性頻率分別為51.85%、48.15%和48.15%，PiKm、Pi2、Pi9、Pikh、和Piks對來自四川省北部18塊病田的病菌的抗性頻率分別為70.00%、60.00%、50.00%、50.00%和45.00%，其中Pi2對四川北部病菌的抗性頻率顯著高于貴州病菌(P=0.0066)。四川稻瘟病菌生理小種鑒別寄主成恢448、內恢99-14和RHR-1對貴州病田來源病菌的抗性頻率分別為74.07%、70.37%和70.37%，對四川北部病田來源病菌的抗性頻率則分別為90.00%、70.00%和90.00%，均顯著高于IR24、明恢63、多恢1號對兩地病菌的抗性頻率。10個雜交稻生產品種對四川北部和貴州省病田稻瘟病菌的抗性頻率分別在90.00%～100.00%和81.48%～92.59%之間波動。對不同病圃和病田的稻瘟病菌毒性的聚類分析結果表明，稻瘟病菌的毒性差異雖然有隨著地理距離擴大而加大的趨勢，但相同縣乃至同一地點不同田塊間病菌毒性也可能有顯著差異，而不同縣(區)的稻瘟病菌則可能因對24個單基因系同時具有毒性而須借助其他水稻品種加以區分。

稻瘟病菌;抗稻瘟病單基因系;抗性頻率;菌株毒性;聚類分析

由子囊菌［Magnaporthe oryzae(Hebert)Barr.］引起的稻瘟病是全世界范圍內水稻生產上最具毀滅性的病害之一，一般流行年份病害引起減產20%～30%，重病田塊甚至絕收［1］。選育和利用抗病品種，是控制稻瘟病最經濟、有效和安全的策略，但是由于稻瘟病菌群體毒性組成復雜并不斷演化，抗病品種大面積種植3～5年后即喪失抗病作用，已成為抗稻瘟病品種選育和利用中的瓶頸問題。因此，對稻瘟病菌群體毒性的時空變化進行監測，對于合理布局抗病品種，延長抗病品種使用壽命，具有重要意義。據不完全統計，四川、重慶和貴州3省(市)水稻面積超過400萬hm2，水稻葉瘟、穗瘟發生面積在50～100萬之間波動，是我國稻瘟病嚴重發生區域之一，水稻抗稻瘟病品種喪失抗性在四川、重慶和貴州屢有發生［2－7］。除少數品種外，多數品種很少普遍表現抗病［8－9］。本研究在四川、重慶和貴州多點設置病圃，種植以麗江新團黑谷為背景的抗稻瘟病單基因系，并采集不同地點穗頸瘟標樣在室內直接產孢病接種上述近等基因系和其他水稻生產品種，以分析不同地點稻瘟病菌群體的毒性差異。通過對四川、重慶和貴州地區稻瘟病菌群體間菌株毒性差異變化的研究，以期為進一步設置病菌毒性監測圃和大面積生產上品種合理布局提供依據。

1 材料與方法

1.1 水稻抗稻瘟病單基因系和品種

24個以麗江新團黑谷為背景的抗稻瘟病單基因新系(表1)系國際水稻研究所(IRRI)和日本專家合作選育而成［10］，由美國Ohio州立大學王國亮教授提供，四川省農業科學院植物保護研究所保存和繁殖。水稻稻瘟病菌生理小種鑒別寄主IR24、明恢63、多恢1號、成恢448、內恢99-14和RHR-1［5］由四川省農業科學院植物保護研究所收集、繁殖和保存。10個抗稻瘟病生產品種商品種子則收集于四川省成都、南充和內江等地種子市場，并依張雪梅等已報道方法［8］在四川邛崍設置病圃中表現抗病。

1.2 病圃設置

2012－2013年間在四川、重慶稻瘟病各縣(市) (表1)稻瘟病常發區設立病圃，將各單基因系播種，播種時間較當地大面積生產播種時間推遲7～14 d，于5月上、中旬將秧苗按照16.5 cm×23.1 cm規格移栽于大田病圃中，每個品種設3次重復，每個重復移栽3行，每行10株，品種呈隨機區組排列。按照常規方法防治水稻蟲害、雜草和其他病害，但不施用防治稻瘟病的藥劑。

1.3 標樣采集

2014－2015年8－9月水稻黃熟期前，到四川位于四川省北部的安縣、鹽亭、南部、蓬安、營山、渠縣、大竹、達川、宣漢、巴州、儀隴等10個縣(區)、貴州省遵義、黔西、金沙、赫章、興仁、興義、安龍、長順、花溪、貴定、都勻、麻江、沿河、天柱等14個縣(區)、以及山東濟南市槐蔭區、濟寧市任城區的稻瘟病發生區采集穗頸瘟標樣，各采樣點選取1塊或不同品種的多塊病田，共計47塊病田進行采樣;采樣時沿病田對角線和稻田四周采取120～150穗病穗，去除谷粒后剪取10～12 cm發病穗頸，風干后放入含變色硅膠的容器內，室溫下干燥保存備用。

1.4 室內播種、育苗及誘發接種

10月底將抗稻瘟病單基因系、恢復系和生產品種用甲基纖維素鈉溶液固定、排列于雙層草紙間，播種于室內水泥池內濕潤育秧苗床表面，各品種播種5～10粒，重復2次，2小區四周播種麗江新團黑谷作誘發行。出苗后0.4～1.0 cm時噴施50%百菌清600倍稀釋液一次預防立枯病，待幼苗生長至2葉1心期時按10 g/m2施用尿素1次，并將保存的穗頸瘟標樣用自來水浸泡4 h，撈出瀝干后撒放在兩小區之上，架設竹拱，覆蓋薄膜將不同地點和田塊來源標樣隔離，用細土將薄膜四周壓實以防交叉侵染直至調查。

1.5 病害調查

田間病圃在7月上、中旬進行，各重復調查100片葉片，按國際水稻所0～9級標準記載葉瘟級別［11］。室內試驗調查在接種后40 d、麗江新團黑谷株發病率達到100%時進行，調查各單基因系和品種的株發病率和最高葉瘟級別。

1.6 數據處理

將各單基因系和品種各重復最高葉瘟級別進行歸總，將各重復中葉瘟最高級別在2級以下者記為抗病(R)，葉瘟級別最高達3級記為中感(MS)，3級以上者記為感病(S)，分析各單基因系和品種中表現抗病和感病的頻率。將MS、S賦值1，R反應賦值為0后，利用Statistica軟件進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 水稻抗稻瘟基因在四川和重慶田間抗性表現

24個抗稻瘟病單基因系、麗江新團黑谷在四川省和重慶市21個病圃中對稻瘟病的抗感表現如表1。不同單基因系在各地的抗性表現具有顯著差異，其中IRBLb(Pib)、IRBLt-K59(Pit)、IRBL12-M［Pi12 (t)］、IRBL19-M［Pi19(t)］及對照麗江新團黑谷在各個病圃均表現感病，表現抗病的頻率為0.00;在多數病圃表現感病、抗性頻率較麗江新團黑谷無顯著差異的有IRBLa-A(Pia)、IRBLi-F5(Pii)、IRBLks-F5(Pi ks)、IRBLk-Ka(Pik)、IRBLkp-K60(Pikp)、IRBLz-Fu(Piz)、IRBLta-K1(Pita)、IRBLsh-B(Pish)、IRBL1-CL(Pi1)、IRBL3-CP4(Pi3)、IRBL5-M［Pi5 (t)］、IRBL7-M［Pi7(t)］、IRBL20-IR24(Pi20)和IRBL11-Zh(Pi11)等14個單基因系。在4個以上病圃表現抗病、抗病頻率顯著高于感病對照的有分別含PiKh、Pi zt、Pi9、Pita2、Pikm、和Pi2等基因的6個單基因系，其中Pi2表現抗病的頻率最高，達38.10 %。從表1可看出，除在各地均表現感病和部分僅在上述病圃其中一個病圃表現抗病的抗稻瘟病單基因系外，大部分單基因系在不同病圃的抗性表現均有差異。

2.2 四川和重慶不同病圃稻瘟病菌群體毒性的聚類分析

由表1可見，除四川省蒲江、儀隴、重慶市萬縣、南川和巴南病圃中稻瘟病菌對所有抗稻瘟單基因系均能致病外，不同地點稻瘟病菌群體對各單基因系的毒性不同。聚類分析結果表明(圖1)，在歐氏距離1.0 h，至少對23個單基因系致病的四川省雅安、蒲江、安縣、儀隴、達縣、通江、巴州、重慶市萬縣、南川、巴南、梁平、墊江和合川等13個病圃聚合為一類，其余病圃均單獨成為獨特類型，其中歷年稻瘟病發生面積較小的四川射洪、重慶江津病圃稻瘟病菌毒性最弱，與其他病圃差異最大。

2.3 水稻抗稻瘟基因、抗性恢復系和生產品種對四川北部和貴州病田稻瘟病菌的抗性

將采自貴州省27塊稻瘟病田和四川省北部18塊病田的穗頸瘟標樣充分浸濕后，接種24個抗稻瘟病單基因系、6個四川稻瘟病菌鑒別寄主和10個前期在邛崍病圃表現抗病的雜交稻組合，薄膜覆蓋隔離，24 h后標樣上即檢測到分生孢子，7 d后透過薄膜開始觀察到病斑，40 d后揭膜進行調查結果如表2。在抗病單基因系中，含有Pia、Pit、Pib、Pii、Pish、Pi1、Pi3、Pi19(t)和Pi20等單基因系對來自貴州或四川病田的稻瘟病菌的抗性頻率與麗江新團黑谷無顯著差異，Piks、Pikh、PiKm對貴州病田稻瘟病菌抗性頻率分別為48.15%、51.85%和48.15%，顯著高于除Pi(7)、Pi11外的其他單基因系。在對來自四川省北部病田的病菌抗性方面，以PiKm的抗性頻率(70.00%)最高，而Piks、Pikh、Pi2和Pi9的抗性頻率分別為45.00%、50.00%、60.00%和50.00 %。通過t測驗發現，Pi2對四川北部病田稻瘟病菌的抗性頻率顯著高于對貴州病菌的抗性頻率(P= 0.0066)。6個四川水稻抗性恢復系中，成恢448、內恢99-14和RHR-1對貴州病田來源病菌的抗性頻率分別為74.07%、70.37%和70.37%，顯著高于IR24、明恢63、多恢1號和除含Piks、Pikh、PiKm外的單基因系。成恢448、內恢99-14和RHR-1對四川北部病田稻瘟病菌的抗性頻率分別為90.00%、70.00%和90.00%，也顯著高于IR24、明恢63、多恢1號和除含Piks、Pikh、Pi2和Pi9外的單基因系。在前期已鑒定表現抗病的10個四川雜交稻生產品種中，對貴州省病田稻瘟病菌的抗性頻率分別在81.48%～92.59%，顯著高于所有抗稻瘟病單基因系。10個抗性生產品種對四川北部病田稻瘟病菌的抗性頻率在90.00%～100.00%，顯著高于除PiKm之外的抗稻瘟單基因系。3個抗性恢復系和10個生產品種對四川北部和貴州來源病菌的抗性頻率無顯著差異(P＞0.0594)。

2.4 四川北部和貴州病田稻瘟病菌群體毒性的聚類分析

除了來自四川蓬安、貴州赫章和貴定3塊病田穗頸瘟標樣的稻瘟病菌對所有單基因系均能致病外，各病田稻瘟病菌群體對24個單基因系的毒性均不完全相同。如加上6個四川稻瘟病菌生理小種鑒別品種，則可以將來自四川、貴州45塊病田，以及山東濟南和濟寧各一塊病田的稻瘟病菌群體毒性完全區分開。將這47塊田病菌對24個單基因系以及6

個鑒別品種的毒性進行聚類分析，發現各病田之間歐氏距離均＞1.0，而在歐氏距離=2.0時，47塊田病菌毒性可以聚合成23個類群，其中第一類群含有來自四川省北部的8塊病田和貴州省不同區域的15塊病田(圖2)，其余類群則均為單成員類群。由圖2可以看出，來自相同縣(區)的不同田塊可以在不同的類群，其中來自遵義市龍坪鎮上水村不同品種的遵義-1、遵義-2、遵義市新民鎮鎮中心村不同品種的遵義-4、遵義-5和遵義-6、沿河縣中界鄉東流村不同品種的沿河-4、沿河-5、沿河-6均可分布在不同類群中。山東濟南和濟寧兩塊病田的病菌毒性與四川、貴州病田病菌毒性差異較大，在歐氏距離≥3.0時才能聚合到一起。

表1 抗稻瘟病單基因系在四川和重慶各地病圃的抗性表現Table 1 Expression of resistance of24 monogenic lines of rice for blast resistance to Magnaportheoryzae atdifferent disease nurseries in Sichuan and Chongqing

表2 接種貴州和四川不同來源穗頸瘟標樣后抗稻瘟病單基因系和品種的抗性表現Table 2 Expression of resistance ofmonogenic lines carrying different resistance genes and rice varieties to Magnaporthe oryzae after inoculation of ear blast specimens of different origins from Guizhou and Sichuan provinces

續表2 Continued table 2

圖1 四川和重慶不同縣(區)病圃稻瘟病菌對24個抗稻瘟病單基因系毒性的聚類分析Fig.1 Cluster analysis of virulence of Magnaporthe oryzae to 24 monogenic lines of rice for blast ressitance

圖2 四川北部、貴州省和山東47塊病田病菌對30個水稻抗稻瘟病單基因系和品種毒性的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of virulence of Magnaportheoryzaeoryzae from 47 paddy fields located in Shandong，Guizhou and northern part of Sichuan province to30 monogenic lines and varieties for blast resistance

3 討論

眾多研究表明，稻瘟病菌群體毒性隨時空而變化［1］。例如2011年至2014年間江蘇省各稻區稻瘟病菌群體毒性的變化［12］，而黑龍江各稻作區土地遼闊稻瘟病菌的毒性分化各不相同［13］。本研究中24個抗稻瘟病單基因系在不同地點的病圃中的發病結果，以及采自不同地區病田穗頸瘟標樣所產分生孢子對各單基因系的致病結果，都表明來自四川、重慶和貴州不同地區的稻瘟病菌群體均可能對24個單基因系同時具有毒性，而加入生產品種可以更好地區分不同田塊之間的病菌毒性差異。各單基因系在不同地區的抗性表現表明，隨著地理距離的進一步擴大，不同區域稻瘟病菌的毒性差異更加明顯。總體上Pi2基因在四川省北部的抗性表現優于貴州、而西南地區與山東病田的稻瘟病菌毒性迥異。

不同地區乃至不同田塊之間稻瘟病菌毒性的差異，不僅反映了不同地點既往和當前種植水稻品種抗性基因對病菌毒性的篩選作用［14］，還為抗性品種篩選病圃的地點設置帶來了困難。四川和重慶不同病圃的研究結果表明，稻瘟病常發區的毒性強于非常發區的射洪和江津，在稻瘟病常發區域設置病圃有利于高抗品種的選育。但常發區之間稻瘟病菌毒性仍有差異，因此利用含有不同抗性基因的水稻品種作為指示品種，選擇發病品種最多的地點作為抗性品種選育過程中的抗性鑒定圃很有必要。但是有研究發現水稻品種的抗病表型具有明顯的地域特征［15］，本研究數據也表明，在部分病田表現抗病的生產品種，并不必然在其他病田表現抗病。

4 結論

不同地區稻瘟病菌群體毒性差異較大［16］，因此各地在進行抗性品種布局時，應針對本區域的稻瘟病菌群體篩選合適的抗病品種。將不同地區尤其是不同省份之間稻瘟病菌引入本地田間病圃而隨氣流傳播，將不利于抗性品種布局。本研究采集不同地區稻瘟病頸瘟標樣在室內產孢、接種不同品種，簡化了接種技術，節約了試驗時間和成本，研究此篩選結果與品種在生產上的實際表現之間的關系并進一步將此技術規范和推廣，將有利于基層農技部門乃至農戶篩選抗病品種。

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(責任編輯 陳虹)

Difference in Virulence of Magnaporthe oryzae from Sichuan，Chongqing and Guizhou

ZHANG Shu1，ZHONG Xue-lian1，QIAO Gui-yan1，SHEN Li2，ZHOU Tian-yun3，PENG Yun-liang1*
(1.Institute of Plant Protection，Sichuan Academy of Agricultural Sciences/MOA Key Laboratory for Integrated Pest Management on Crops in Southwest China，Sichuan Chengdu 610066，China;2.Plant Protection Station，Sichuan Provincial Department of Agriculture，Sichuan Chengdu 610042，China;3.Chongqing Municipal Station of Seed Management，Chongqing 401121，China)

Sichuan，Chongqing and Guizhou are among the most important areas for rice blast disease(Magnaporthe oryzae)to take place and cause losses.To investigate the difference in the virulence of blast fungus between the different regions，itwill be benefit for prolonging the use of resistance cultivars.In 2012 and 2013，24 monogenic linesof rice for blast resistance of the common background of Lijiangxintuan Heigu(LTH)were planted at the locations of frequent epidemic of blast disease in 21 counties of Sichuan province and Chongqing city.In 2014 and 2015，panicle blast specimenswere collected from totally 47 paddy fields from 15 counties in whole Guizhou provice，10 counties in the northern part of Sichuan Province and 2 counties in Shandong provincesand immersed in water for4 hoursbefore they were inoculated on the arrays of16 varieties and the 24 monogenic lines of rice.After themulching and complete segregation by plastic membrane for 40 days，to investigate the rice blast incidences of16 varieties and the24 monogenic lines，The sesult of experiment in 2012 and 2013 indicate that resistance gene Pi2 was then found to express the resistance in 38.10%of the disease nurseries.The rice blast identification results of panicle blast specimens which collecting form Sichan，Guizhou and other place indicate that resistance genes Pikh，Piks，and PiKm were found to be resistant to blast fungus respectively from 51.85%，48.15%and 48.15%of the disease fields in Guizhou，PiKm，Pi2，Pi9，Pikh，and Pikswere resistant to theblast fungus respectively from 70.00%，60.00%，50.00%，50.00%and 45.00%of the disease fields in Sichuan.The frequency for Pi2 to be resistant to the blast fungus from fields in northern part of Sichuan was significantly higher than that in Guizhou(P=0.0066).The frequencies for 3 differential host varieties i.e.Chenghui448，Neihui99-14 and RHR-1，to be resistant to blast fungus from the fields in Guizhou and northern part of Sichuan were respectively 74.07%，70.37%and 70.37%vs.90.00%，70.00%and 90.00%，which were significantly higher than that for other three differential host varieties，i.e.IR24，Minghui63 and DuohuiNo.1.The frequencies for 10 hybrid rice varieties to express the resistance to blast fungus from the fields in Guizhou and northern partof Sichuan varies respectively between 81.48%－92.59%and 90.00%－100.00%.While the cluster analysis of the virulence of blast fungus in the disease nurseries and paddy fieldshad indicated the bigger difference in virulence roughly in accordance to the geographic distance，the virulence of blast fungus from the different fields in same county and even the same sampling sites could be significantly different.On the other hand，the blast fungus from different counties and different provinces could be virulent to all of the 24 monogenic lines and the further differentiation of the virulence relied on other rice varieties.

Magnaporthe oryzae;Monogenic lines of rice for blast resistance;Resistance frequency;Virulence of isolate;Cluster analysis

S435.111

A

1001－4829(2017)2－0359－07

10.16213/j.cnki.scjas.2017.2.020

2016－03－20

公益性(農業)行業專項(201203014);國家水稻產業技術體系專項經費(CARS-01-25);四川省育種攻關項目(YZGG2016-25)

張姝(1988－)，女，四川新都人，碩士，從事水稻病蟲綜合防控研究，E-mail:becky_zs@126.com，*為通訊作者:彭云良，E-mail:pengyunliang@aliyun.com。