人參皂苷Rg1對H2O2誘導的HT22細胞凋亡及胞內Ca2+變化的影響

劉曉丹，成紹武，范婧瑩，宋禎彥，李 平，鄧常清*（.湖南中醫藥大學 中西醫結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室；.湖南中醫藥大學 中西醫結合學院，.湖南中醫藥大學 醫學院，湖南 長沙 408）

人參皂苷Rg1對H2O2誘導的HT22細胞凋亡及胞內Ca2+變化的影響

劉曉丹1，成紹武1，范婧瑩2，宋禎彥1，李 平1，鄧常清3*
（1.湖南中醫藥大學 中西醫結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室；2.湖南中醫藥大學 中西醫結合學院，3.湖南中醫藥大學 醫學院，湖南 長沙 410218）

目的 研究人參皂苷Rg1對H2O2誘導的HT22細胞凋亡及胞內Ca2+濃度變化的影響。方法 以0、6.25、12.5、25、50、100μg/L人參皂苷Rg1預處理細胞24 h，采用Ca2+熒光染料探針Fluo-3/AM負載細胞1 h后，50 mmol/L H2O2刺激細胞，多功能酶標儀測定熒光強度，激光共聚焦顯微鏡實時監測[Ca2+]i變化，Hoechst 33258染色檢測細胞凋亡。結果 H2O2可誘導細胞內Ca2+濃度增加（P＜0.01),并增加細胞凋亡率（P＜0.01)。不同濃度人參皂苷Rg1可呈劑量依賴性的抑制H2O2誘導的HT22[Ca2+]i增加（P＜0.01），抑制細胞凋亡（P＜0.01)，以50μg/L的作用為最強（P＜0.01)。結論 人參皂苷Rg1可通過降低H2O2誘導的HT22細胞內Ca2+水平的升高，抑制氧化應激引起的細胞凋亡。

人參皂苷Rg1；HT22細胞；細胞凋亡；Ca2+濃度

本文引用：劉曉丹，成紹武，范婧瑩，宋禎彥，李 平，鄧常清.人參皂苷Rg1對H2O2誘導的HT22細胞凋亡及胞內Ca2+變化的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（3）：236-239.

腦缺血發病率高、死亡率高、致殘率高，嚴重威脅人類健康，且病理生理機制復雜，目前仍未完全清楚。近年來的腦缺血損傷的病理生理機制研究表明，神經細胞的胞外Ca2+內流增加可引發細胞變性，最后導致死亡；興奮性氨基酸及多種神經毒素引起神經細胞變性死亡，總是伴隨胞漿Ca2+超負荷現象，故認為細胞Ca2+信號轉導異常是神經元變性的 “最后共同通道”[1]。

人參皂苷Rg1是人參、三七的主要有效成分，對心血管、中樞神經系統均有較強的保護作用，有研究發現[2-6]，人參皂苷Rg1能夠減輕腦缺血再灌注損傷，其機制可能與抑制神經細胞凋亡、抗氧化損傷等有關。本研究通過采取H2O2誘導的HT22細胞損傷模型，觀察人參皂苷Rg1預處理對H2O2誘導的HT22細胞凋亡的影響，并通過分析細胞內[Ca2+]i的變化，探索人參皂苷Rg1抗HT22細胞凋亡的作用及與[Ca2+]i的關系，為人參皂苷Rgl在腦缺血的治療應用上提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 人參皂苷Rg1（批號：MUST-16022407）,購自成都曼思特生物科技有限公司，純度≥98%；H2O2（美國sigma公司），Fluo-3/AM（（美國sigma公司），α-MEM培養基、胎牛血清、青鏈霉素溶液、PBS緩沖液、改良臺式液均購自GIBCO公司。

1.1.2 細胞 HT22細胞，小鼠海馬神經元細胞系，低分化，購自中南大學湘雅醫學院。

1.1.3 主要儀器 激光共聚焦顯微鏡 （日本尼康，型號：A1+)，多功能酶標儀 （德國BIOTEC，型號：CYTATION3)，超凈工作臺(蘇州，型號：8WJ-2F0)，倒置顯微鏡(重慶，型號：XDS-1B)，二氧化碳培養箱(德國賀利氏，型號：Heracel1）。

1.2 實驗方法

1.2.1 HT22細胞培養 采用含10%胎牛血清，1%青鏈霉素溶液的α-MEM培養基，于37℃、5%CO2濃度及飽和濕度下的培養箱中培養，每天換液，待單層細胞生長至80%～90%融合后傳代培養，所有實驗采用對數生長期細胞。

1.2.2 人參皂苷Rg1最適濃度摸索 細胞共分為7組，正常組（α-MEM無血清培養基常規培養）、H2O2損傷組（加入50 mmol/L H2O2刺激細胞）、不同濃度人參皂苷Rg1（6.25、12.5、25、50、100 μg/L）組。細胞加入不同濃度人參皂苷Rg1處理24 h后，棄去培養基，用臺式液洗滌2次，加入Fluo-3/AM工作液（熒光探針Fluo-3/AM在負載細胞時用臺式液配制成終濃度為 5 μmol/L的工作液），37℃避光培養1 h，棄去熒光探針，用臺式液洗滌2次，加入含終濃度為50 mmol/L H2O2的臺式液繼續孵育1 h。在多功能酶標儀下，選擇激發波長488 nm進行掃描，讀取熒光強度值。

1.2.3 激光共聚焦顯微鏡檢測細胞內鈣離子濃度 細胞分為3組，正常組（ɑ-MEM無血清培養基常規培養）、H2O2損傷組及人參皂苷Rg1組（加入上述實驗摸索的人參皂苷Rg1最適濃度）培養24 h。Fluo-3/ AM負載1 h后，棄去熒光探針，用臺式液洗滌2次，H2O2損傷組和人參皂苷Rg1組加入含終濃度為50 mmol/L H2O2的臺式液，在激光共聚焦顯微鏡下觀察選擇貼壁良好、形態伸展、熒光強度較亮的細胞，設置掃描條件為488 nm波長激發、20%激光強度，同時采集DIC圖像，每3分鐘采集1張，連續掃描1 h，動態觀察熒光強度變化情況。選取第1張圖片，15、30 min和1 h4張圖片利用Image J統計軟件進行平均熒光強度分析。

1.2.4 Hoechst 33258染色檢測細胞凋亡 細胞分組及處理同上，處理完成后，用PBS漂洗細胞2次，加入新鮮配置的4%多聚甲醛，4℃固定15 min；PBS洗2次后，加入終濃度為5 mg/L的Hoechst 33258室溫下作用5 min。在倒置熒光顯微鏡下觀察，隨機選取5個200×鏡下視野，計算凋亡細胞百分率。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 不同濃度人參皂苷Rg1對細胞內Ca2+濃度的影響

H2O2刺激后，熒光強度顯著增高（P＜0.01），提示細胞內Ca2+濃度水平顯著增加。人參皂苷Rg1不同濃度組均能夠顯著抑制H2O2損傷后細胞熒光強度的增高（P＜0.05-P＜0.01），其中以50 μg/L濃度最為明顯（見表1）。故在下面的實驗中選擇50 μg/L濃度的人參皂苷Rg1進行實驗。

表1 不同濃度人參皂苷Rg1對H2O2誘導的HT22細胞內Ca2+的熒光強度值影響 （n=5，±s)

表1 不同濃度人參皂苷Rg1對H2O2誘導的HT22細胞內Ca2+的熒光強度值影響 （n=5，±s)

注：與正常組比較**P＜0.05,與H2O2損傷組比較△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別正常組H2O2損傷組6.25 μg/L濃度組12.5 μg/L濃度組25 μg/L濃度組50 μg/L濃度組100 μg/L濃度組F P熒光強度值7 814.6±430.62 45 496±156 5.1** 37 584±154 5.7△29 211±281 3.6△26 341±457.17△△16 015±108 8.3△△17 318±351.45△△23.268 0.019

2.2 激光共聚焦顯微鏡實時監測人參皂苷Rg1對H2O2誘導的HT22細胞內鈣離子熒光強度動態變化

正常細胞胞漿內鈣離子濃度較低，在488 nm激發光激發下發出較弱的綠色熒光，且隨著時間的延長，熒光強度無變化（0、15、30 min和1 h）4個時間點熒光強度分別為 70.61、71.12、71.13、71.21）；H2O2刺激后，細胞胞漿內鈣離子濃度迅速增高，熒光強度顯著增高，在30 min達到峰值（0、15、30 min和1 h 4個時間點熒光強度分別為 90.12、126.45、150.22、136.8）（P＜0．05-P＜0．01），50 μg/L濃度的人參皂苷Rg1能夠有效抑制H2O2損傷后細胞熒光強度的增高 （0、15、30 min和1 h 4個時間點熒光強度分別為94、125.6、102、98.3）（P＜0．05），見圖1。

2.3 人參皂苷Rg1對H2O2誘導的HT22細胞凋亡的影響

Hoechst 33258染色結果顯示，正常組細胞呈現彌漫均勻的低熒光強度，未見凋亡細胞。經H2O2刺激后，細胞呈現明顯的凋亡特征，表現為細胞核濃縮、破裂，與正常組比較，細胞凋亡率顯著升高，達（50.12±1.4）%（P＜0．01），人參皂苷Rg1能夠有效地抑制細胞凋亡，使凋亡細胞顯著減少，細胞凋亡率為（22.04±2.8）%（P＜0．01），見圖2。

圖1 激光共聚焦顯微鏡實時監測不同時間點人參皂苷Rg1對H2O2誘導的HT22細胞[Ca2+]i變化的影響（×200）

圖2 Hoechst 33258染色檢測人參皂苷Rg1對H2O2誘導的HT22細胞凋亡(倒置熒光顯微鏡×200)

3 討論

腦缺血損傷機制復雜未明，腦缺血時神經元損傷因素包括興奮性氨基酸釋放過多、自由基產生增加以及能量代謝障礙等，大多都伴有胞漿內Ca2+濃度升高。現代研究發現[7]，Ca2+超載可觸發一系列下游反應，包括胱天蛋白酶的激活、ATP合成障礙、鈣依賴性蛋白酶和核酸酸內切酶的激活等，而這些事件最終導致神經元的損傷和死亡，細胞內Ca2+超載是缺血性神經元損傷的共同徑路。本研究發現，HT22細胞損傷后，細胞內Ca2+濃度明顯增高，且隨著鈣離子濃度的增高，細胞凋亡率越高，表明鈣超載可能是引起神經元死亡和損傷的重要途徑。這與以往的研究相符[8-9]。

人參皂苷Rg1是存在于人參、三七的主要活性成分，現代藥理研究發現，人參皂苷Rg1具有較強的抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤、提高免疫力等藥理作用。近年來，人參皂苷Rg1對心血管和中樞神經系統的保護作用，越來越受到國內外學者的關注。大量動物實驗和體外細胞實驗表明[10-13]，人參皂苷Rg1能通過抑制神經元凋亡，減少谷氨酸釋放，抗炎癥反應、清除自由基、促進神經元修復和再生等機制改善腦缺血再灌注損傷。本研究通過H2O2建立HT22細胞氧化損傷模型，研究人參皂苷Rg1能否抑制鈣超載，抑制氧化應激引起的神經細胞凋亡，從而減輕腦缺血損傷。研究表明，人參皂苷Rg1可成劑量依賴性的減輕氧化應激引起的神經細胞凋亡，其機制與抑制鈣超載有關。

Fluo3-AM為一種脂溶性染料，自身不與Ca2+結合，在細胞內經脂解脫去脂基后生成游離Fluo3，后者是一敏感性鈣指示劑，與游離的Ca2+特異性結合，并在一定波長激發后產生熒光，其熒光強度與Ca2+濃度成正比，因而熒光值可反應Ca2+濃度的變化情況。

H2O2是一類ROS，它不僅能直接氧化細胞膜上的脂質及蛋白，而且能自由穿過細胞膜和細胞內鐵離子反應生成·OH等活性更強的自由基，導致系列反應。H2O2具有獲得容易、性質穩定和操作簡單等特點，因此目前H2O2是各類細胞氧化損傷模型中應用最為廣泛的應激源之一[14]，因此本項目用H2O2損傷細胞來建立HT22細胞氧化損傷模型是可行的。

[1]Matsude T，Arakawa N，Takuma K,et al．SEA0400，a novel and selective inhibitor of the Na+-Ca2+exchanger attenuates rep effusion injury in the vitro and in vivo cerebral ischemic models [J]．J Pharmacol Exp Ther，2001，298(1)：249-256.

[2]吳 露,黃小平,鄧常清,等.人參皂苷Rg1對小鼠腦缺血再灌注后腦組織損傷及Nrf2/HO-1途徑的影響[J].中國病理生理雜志,2013,29 (11):2066-2071.

[3]劉曉丹，鄧常青.黃芪甲昔和三七總皂昔中有效成分抗PC12細胞氧化損傷的配任研究[J].湖南中醫藥大學學報,2012,32(1):8-12.

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[5]陳 彥,吳鴻浩,何 斌,等.人參皂苷Rg1對大鼠海馬神經元缺糖氧/復糖氧后鈣內流的影響[J].中國急救醫學,2012,32(11):1001-1004.

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[9]石詠梅.腦缺血/再灌注神經元鈣離子通道的研究進展[J].醫學綜述,2014,20(14):2507-2509.

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（本文編輯 楊 瑛）

Effect of Ginsenoside Rg1on H2O2Induced Apoptosis and Intracellular Ca2+Concentration in HT22 Cells

LIU Xiaodan1,CHENG Shaowu1，FAN Jingying2，SONG Zhenyan1，LI Ping1，DENG Changqing3*

(1.Key Laboratory of Hunan Province of Rebrovascular Disease Prevention and Treatment of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.College of Integrated of Traditional Chinese and Western Medicine,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China; 3.Medical School,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To investigate the effect of ginsenoside Rg1on H2O2induced apoptosis and intracellular Ca2+concentration in HT22 cells.Methods Ginsenoside Rg1with 0,6.25,12.5,25,50 and 100μg/L were used to pre-processing HT22 cells for 24 h,separately.Ca2+fluorescent probe Fluo-3/AM was used to load cells for 1h.Then using 50 mmol/L H2O2stimulate cells.The fluorescence intensity was measured for microplate reader, [Ca2+]i changes were monitored by scanning confocal microscopy.Apoptosis were tested by Hoechst 33258 staining.Results The Ca2+concentration (P＜0.01)and apoptosis (P＜0.01)induced by H2O2increased significantly.Different concentrations of ginsenoside Rg1showed dose dependent inhibition in increasing the HT22[Ca2+]i (P＜0.01)and apoptosis(P＜0.01)induced by H2O2,and the concentation of 50μg/L shows strongest effect(P＜0.01).Conclusion The ginsenoside Rg1could inhibit apoptosis of oxidative apoptosis by reducing the cellular Ca2+level induced by H2O2.

ginsenoside Rg1;HT22 cell;apoptosis;Ca2+concentration

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.03.002

2016-08-30

國家自然科學基金項目（81473581），湖南省教育廳項目（14C0859），中西醫結合防治心腦疾病的相關基礎研究湖南省高校科技創新團隊項目（2015CXTD），中西醫結合基礎湖南省重點學科開放基金項目。

劉曉丹，女，碩士，實驗師，研究方向：心腦疾病中西醫結合防治研究。

*鄧常清，男，博士，教授，博士研究生導師，E-mail：dchangq@@sohu.com。