高血壓心力衰竭大鼠動物模型的研制

李欣春，梁 昊，胡志希*，胡思遠，文 陽，鐘森杰，李 琳（湖南中醫藥大學中醫診斷研究所，湖南 長沙 410007）

高血壓心力衰竭大鼠動物模型的研制

李欣春，梁 昊，胡志希*，胡思遠，文 陽，鐘森杰，李 琳
（湖南中醫藥大學中醫診斷研究所，湖南 長沙 410007）

目的 研制高血壓引起的心衰大鼠動物模型。方法 將18只Dahl鹽敏感性大鼠分為正常組和模型組并分別使用0.3%NaCl低鹽飼料和8%NaCl高鹽飼料喂養大鼠20周，觀察大鼠行為及體征，檢測大鼠血壓、血清氨基末端腦鈉肽前體（N-terminal Pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP）含量，彩色超聲多普勒檢測大鼠左室射血分數（left ventricular ejection fraction,LVEF）和左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening,LVFS）及電鏡觀察HE染色心肌細胞以及腎臟組織等。結果 正常組大鼠血壓一直維持在140 mmHg左右，而模型組大鼠從進食高鹽飼料后血壓保持持續上升，最高可達250 mmHg；與正常組比較，模型組的NT-proBNP、LVEF、LVFS在統計學上有顯著差異（P＜0.01）。結論 本研究制作的動物模型可較好地模擬正常大鼠繼發高血壓病進而發展成高血壓心衰大鼠模型的過程，可用于高血壓心力衰竭疾病的研究。

高血壓；心力衰竭，Dahl鹽敏感性大鼠；大鼠動物模型

心力衰竭是各種心血管疾病的終末期表現和最主要的死因，其發病率高，5年存活率與惡性腫瘤相仿[1]。我國最近一次高血壓流行病學調查發現：18歲以上人群高血壓患病率為18.8%，并且隨著年齡的增加，高血壓導致心衰患病率迅速增加，發病率居世界前列[2]。而高血壓性心臟病一般進展為心室肥大和纖維化，最終導致舒張性心力衰竭（diastolic heart failure,DHF）。世界衛生組織研究發現，高血壓、左室肥厚（left ventricular hypertrophy,LVH）和冠心病是導致舒張功能障礙的主要危險因素。Bonow等發現左室DHF中53%～60%為高血壓性心臟病，20%～26%為冠心病，10%為肥厚性心肌病。以上數據證明高血壓是引起左室DHF的常見病因之一[3]。DiNicolantonio研究發現，攝入過量食鹽能引起高血壓及與其相關的并發癥，如舒張性心力衰竭，而控制高血壓可有效降低發生心力衰竭的危險[4]。

高患病率、高住院率、高病死率及由此帶來的巨大經濟負擔，使得心力衰竭一直為國內外醫學研究的重點和熱點。為了更好地研究高血壓心衰疾病，迫切需要研制一種穩定、可靠，且具有較高重復性的高血壓心衰動物模型。因此，本文以Dahl鹽敏感性大鼠為材料，闡述了高血壓心衰大鼠的制作以及模型評價方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SPF級Dahl鹽敏感性大鼠18只，體質量（220±10）g，由北京維通利華動物公司提供，動物合格證編號為：No.11400700134072，飼養于湖南中醫藥大學動物實驗中心SPF級實驗室內。

1.2 儀器與主要試劑

超低溫冰箱Forma 900 series，美國Thermo公司；5417R型小型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；SonoScape-S2N型彩色多普勒超聲診斷儀，深圳開立科技有限公司；移液槍K39270B，200 μL，德國Eppendorf公司；智能無創血壓計BP-2010A，北京Softron公司；大鼠NT-proBNP ELISA試劑盒48T，SINOBESTBIO公司，產品批號：G19031685。

1.3 造模方法

將18只Dahl鹽敏感性大鼠分為正常組與模型組，每組9只，每3只老鼠一籠。正常組大鼠喂養0.3%NaCl低鹽飼料，模型組大鼠喂養8%NaCl高鹽飼料，每籠每天喂養飼料60 g，水450 mL，每2天換洗籠子1次。共喂養20周。

1.4 檢測方法與指標

1.4.1 行為及體征觀察 每天早、中、晚觀察大鼠的體征、精神狀態、飲食情況、活動狀況。

1.4.2 血壓監測 采用大鼠智能無創血壓計檢測大鼠的血壓變化，每15天檢測1次。同時，記錄血壓變化對大鼠的行為體征產生的影響。

1.4.3 超聲心動圖檢測 用SonoScape-S2N型彩色多普勒超聲診斷儀，在二維超聲引導下用M型超聲經胸骨左心室長軸切面測量左室舒張末期內徑（LVEDD），左室收縮末期內徑（LVESD），求3個心動周期的平均值，并按照Teichholtz公式計算左心室射血分數（LVEF）及左室短軸縮短率（LVFS）。

1.4.4 心肌細胞和腎臟HE染色 取出大鼠心臟和腎臟后經固定、脫水、包埋以及切片后，將心臟切片和腎臟切片用蘇木精—伊紅染色法染色，在光鏡下以200倍或400倍觀察心肌細胞及腎單位的形態學變化。

1.4.5 血清NT-proBNP樣本制備及檢測方法 目前，NT-proBNP是診斷心力衰竭較好的指標[5]。大鼠經10%水合氯醛按4 mL/kg計量腹腔注射麻醉后，使用采血針和采血管給大鼠腹主動脈取血，采血完畢常溫靜置 20 min后，以 3 500 r/min離心10 min，立即提取上清液分裝在離心管里放在零下80℃冰箱里保存。待測時，先將血清室溫放置2 h后，1 000 r/min離心15 min，使用酶聯免疫吸附測定法（ELISA）對血清進行NT-proBNP含量檢測。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 大鼠成活情況

造模周期內，9只正常組大鼠均存活；9只模型組大鼠死亡2只。

2.2 模型動物一般狀況觀察

正常組大鼠動靜如常，行為正常，毛發光澤呈白色，抓取時稍有反抗，性情較溫順；模型組大鼠精神亢奮，咬籠打架，時常有大鼠腿部或尾部出血，毛發枯槁，無光澤，腹部毛發稀疏，抓取時反抗劇烈，時常跳躍反弓軀體試圖咬人。

2.3 大鼠血壓監測值比較

從圖中得知，模型組自從喂食高鹽飼料后，一直處于高血壓狀態，血壓甚至達到220 mmHg以上；而喂食低鹽飼料的正常組血壓基本維持在140 mmHg以下，尚未達到高血壓診斷指標（140 mmHg），難以構成心臟器質性病變，見圖1。

2.4 各組大鼠心功能參數比較

造模結束后，模型組LVEF、LVFS明顯低于正常組，與正常組比較差異有顯著統計學意義（P＜0.01），見表1。結合圖1，說明由于受血壓影響對各組大鼠LVEF和LVFS產生了差異。

圖1 大鼠血壓觀測圖

表1 各組大鼠心功能參數比較 （%,±s）

表1 各組大鼠心功能參數比較 （%,±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01。

2.5 心肌HE染色比較

正常組:心肌結構清晰，心肌閏盤、橫紋清晰，橫切面可見心肌纖維排列均勻、整齊，心肌細胞核位于邊緣，核大小、形態正常，心肌纖維未見斷裂缺損及空白區，見圖2。模型組：心肌結構模糊，心肌閏盤不清，橫紋消失，肌纖維呈波浪形排列，細胞間縫隙增大，心肌細胞水腫增大或溶解，出現大量的炎癥細胞。從心肌HE染色圖片可以得知，不同組別心肌病理學形態存在較大的差異，模型組大鼠心肌細胞水腫、脫落，肌纖維溶解恰好解釋了模型組大鼠EF以及FS明顯降低的原因。

圖2 心肌細胞顯微光鏡觀察圖（HE×400）

2.6 腎單位HE染色

正常組：腎小球內毛細血管清晰，基底膜無增厚或皺縮，近端小管及遠端小官官腔形態大小正常，且內部均無異常管型，見圖3。模型組：腎小球內纖維化嚴重，只可見少量的毛細血管，基底膜皺縮，近端小官及遠端小官上皮細胞空泡變性及脫落，其內部可見大量蛋白管型。

圖3 腎單位光學顯微鏡圖(HE)

2.7 大鼠血清NT-proBNP指標檢測

與正常組比較，模型組NT-proBNP增多明顯增高，兩總體均數差異有統計學意義（P＜0.01），說明制作高血壓心力衰竭模型較為成功，見表2。

表2 各組大鼠血清NT-proBNP比較 （±s，pg/mL）

表2 各組大鼠血清NT-proBNP比較 （±s，pg/mL）

注：與正常組比較，#P＜0.01。

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3 討論

Dahl種是一種遺傳性鹽敏感性高血壓動物模型，Dahl將大鼠的子代進行重復交配，培養出通過遺傳性鹽負荷使血壓升高的S種(Dahl鹽敏感性大鼠：DSR)和正常血壓的R種(Dahl鹽非敏感性大鼠：DRR)。將DSR的腎移植給DRR時，DRR便產生鹽敏感性高血壓，反之，將DSR的腎與DRR的腎置換時，DSR的血壓轉為正常，表明攝鹽的確與高血壓發病相關。Dahl鹽敏感性高血壓大鼠是遺傳性高血壓大鼠的品系之一，該模型無需進行手術和專門給藥，只需在其生長過程中給予鹽即可成為高血壓模型[6]。因此，依據該種大鼠生理特性，即進食高鹽飼料血壓即升高，而進食低鹽飼料對血壓無影響，本實驗無需設置空白對照組，進食低鹽飼料的即為正常組，而進食高鹽飼料的即為模型組。另外，與進食低鹽飼料的Dahl種大鼠相比，進食高鹽飼料的Dahl種大鼠隨著血壓升高會伴有嚴重的腎小球硬化，血液中血管緊張素II（Angiotensin II,Ang II）含量也較少[7]。因此，由于該種類大鼠對鹽敏感程度較高，如不加以控制飲食，長期大量攝入鈉鹽極易引起腎小球濾過功能降低、近端小管及遠端小管重吸收能力減弱導致大量蛋白丟失、血容量下降、腸道蠕動減弱[8]，以至于大鼠生命后期體格瘦小，腹部卻膨隆。因此，我們在喂養的時候應控制大鼠每日飲食鈉鹽的含量，模型組按照平均每只大鼠每日進食1.6 g NaCl的量喂養，雖然可見模型組大鼠血壓穩步上升，但是在喂養至120 d時，有2只大鼠死亡，解剖后發現膨隆的腹部里是腸管內淤積的糞便，這也和臨床上腎衰竭合并腸梗阻的病例相符[9]。鑒于此結果，我們后期還可以繼續探究既可以保證高血壓心衰大鼠模型成功又可以降低死亡率的每日進食鈉鹽含量臨界值范圍。也正是由于死去的2只大鼠導致在第120天測量大鼠血壓時平均值降低。

實驗結果顯示即使模型組大鼠的左室射血分數也并沒有低于40%，即該模型不是收縮期心衰；反而其射血分數一直保持在50%以上，理應是射血分數保留的心衰，符合高血壓導致心力衰竭的病理變化[10]。但是從HE染色結果得知，心肌細胞部分水腫和溶解，必然會導致心肌收縮能力減弱，因此模型組的射血分數比正常組低。NT-proBNP是B型腦鈉肽（BNP）分裂后的N端片段，目前已知它血清中濃度高，半衰期較BNP長，且為一直鏈結構，體外生物活性穩定，易檢測，可用于評價心功能[5]。同時，有研究證實，NT-proBNP水平隨美國紐約心臟病學會（NYHA）首先提出的心功能分級增加而升高，隨治療后病情緩解而呈明顯下降[11]。因此，NT-proBNP是判斷心力衰竭程度的一個重要指標。

通過了解NT-proBNP對診斷心衰疾病的意義，以及Dahl鹽敏感性大鼠的生理特性，結合本實驗左室射血分數、短軸縮短率和心肌HE染色結果可得知，通過高鹽飼料喂養Dahl鹽敏感性高血壓大鼠可以很好地模擬高血壓病發展為高血壓心衰疾病的動態模型，可為研究高血壓心力衰竭提供一個可靠的動物模型。

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（本文編輯 楊 瑛）

Building of Hypertensive Heart Failure Rat Models

LI Xinchun,LIANG Hao,HU Zhixi*,HU Siyuan,WEN Yang,ZHONG Senjie,LI Lin (Diagnostic Institute of Traditional Chinese Medicine,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China)

Objective To build the rat model of hypertension heart failure.Methods Eighteen Dahl salt sensitive rats were divided into normal group and model group feed by 0.3%NaCl low-salt and 8%NaCl high-salt for 20 weeks,respectively.After 20 weeks,the daily behavior and physical signs of the rats were observed.The blood pressure,serum N-terminal-pro-brain-natriuretic-peptide (NT-proBNP)content of the rats were observed.The left ventricular ejection fraction(LVEF) and left ventricular fractional shortening(LVFS)were measured by color doppler ultrasound instrument.The HE dyed myocardial cellsand kidneytissuewereobserved byelectron microscopeoftherats.ResultsBlood pressure ofnormalgroup rats maintained at about 140 mmHg,and blood pressure of the model group rats kept rising up to 250 mmHg after eating high-salt feed.Compared with normal group,there are significant differences in the NT-proBNP,LVEF and LVFS(P＜0.01). Conclusion The rats model can well simulate the disease process that normal secondary hypertension rats develop hypertensive heart failure rats.The rat model can be used for the research of hypertensive heart failure disease.

hypertension;heart failure;Dahl salt sensitive rats;rat models

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2017.03.004

2016-09-13

國家自然科學基金項目(81373550)。

李欣春，男，在讀碩士研究生，研究方向：心血管疾病證本質與診治規律。

*胡志希，男，教授，博士研究生導師，E-mail:5471313@sohu.com。

本文引用：李欣春，梁 昊，胡志希，胡思遠，文 陽，鐘森杰，李 琳.高血壓心力衰竭大鼠動物模型的研制[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（3）：245-248.