中藥菊花過氧化物酶酶學特性及炮制工藝的研究

蘇 靖，劉守金*，朱晶晶，朱玉蕓,(.安徽中醫藥大學，安徽 合肥 30000；.中國中醫科學院中藥研究所，北京 0070）

中藥菊花過氧化物酶酶學特性及炮制工藝的研究

蘇 靖1，劉守金1*，朱晶晶2，朱玉蕓1,2
(1.安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230000；2.中國中醫科學院中藥研究所，北京 10070）

目的 探討中藥菊花過氧化物酶酶學特性及炮制工藝。方法 以愈創木酚為底物,采用分光光度法測定菊花過氧化物酶的酶學特性，并比較不同加工工藝下菊花過氧化物酶學特性及總黃酮含量。結果 菊花反應時間不宜超過2 min,最適pH 7.0,最適溫度36℃,100℃處理30 s后，過氧化物酶活性完全喪失。過氧化物酶催化的酶促褐變反應動力學符合米氏方程，動力學參數Km=1.58×10-2mol/L,Vmax=14.278 U/min。四種炮制工藝比較過氧化物酶的抑制效果為水蒸汽＞微波干燥＞80℃熱風干燥＞自然陰干。分光光度計法測定樣品總黃酮含量,蒸制干燥＞微波干燥＞80℃熱風干燥＞自然陰干。結論 菊花過氧化物酶適應溫度范圍廣，20～80℃，相對耐熱性好。本研究可為中藥菊花炮制工藝的改善提供理論參考。

菊花；過氧化物酶；酶學特性；炮制工藝；黃酮

中藥菊花為菊科植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥頭狀花序[1]。菊花性能辛、甘、苦，微寒。歸肺、肝經。功效，疏散風熱，平抑肝陽，清肝明目，清熱解毒[2]。9-11月花盛開時分批花采收后，陰

干或焙干，或熏、蒸后曬干，生用[3]。主產于浙江、安徽、河南等省。多栽培。因為菊花中的主要活性成分極易發生酶促褐變,即其所含的酚類物質在過氧化物酶、多酚氧化酶的作用下氧化成醌,再經聚合形成褐色物質,而產生顏色裂變,嚴重影響產品的外觀和質量[4-5]。過氧化物酶酶學特性目前農作物報道多[6]，香蕉[7-8]、雪蓮果[9]、橄欖[10]、甘薯葉[11]、楊桃[12]等。針對菊花過氧化物酶的酶學特性鮮見報道[13]。菊花中目前知道的化合物主要是黃酮、多酚等[1]，研究表明，不同干燥方法對菊花的多酚、黃酮類活性成分均有一定影響[4]，菊花藥材按產地和加工方法的不同，分為“亳菊”“滁菊”“貢菊”“杭菊”等，以亳菊和滁菊品質最優。我國菊花的藥用類群通過人工長期栽培選育,已形成一些相對穩定的栽培變種,本實驗通過對新栽培變種大馬牙菊花過氧化物酶的部分酶學特性進行分析[14-15]，探討總黃酮的含量與酶的活性變化趨勢關系，以期為菊花炮制工藝提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑

菊花2015年11月6日-11月12日采自安徽亳州十九里鎮農戶地里，采集全花，經安徽普仁中藥飲片有限公司質量負責人段體斌老師鑒定為大馬牙菊花Dendranthema morifolium(Ramat.)Tzvel.Damay a'cv.nov，新栽培變種。在亳州安徽普仁中藥飲片公司采用不同炮制方法制備，-80℃冰箱保存備用。愈創木酚：天津市光復精細化工研究所；二氧化硅：天津市永大化學試劑有限公司；過氧化氫、磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉：北京化工廠。

1.2 實驗儀器

梅特勒-托利多XSE150分析天平 （瑞士蘇黎世）；TGL20MW臺式高速冷凍離心機 （湖南赫西儀器裝備有限公司）；T6 UV-VIS分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；電熱鼓風干燥箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；EYELA水浴鍋SB-1100（上海愛朗儀器有限公司）;Agilent 1260高效液相色譜系統。

1.3 實驗方法

1.3.1 菊花過氧化物酶粗酶液的提取 稱取新鮮菊花0.5 g,加適量石英砂，5 mL pH 7.0磷酸緩沖液冰浴研磨。提取物在4℃條件下以6 000 r/min離心6 min，收集上清液作為粗酶液待測。

1.3.2 菊花過氧化物酶的活性測定 取光徑1 cm比色皿2只，于1只加入50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0)50 μL，含有愈創木酚的反應混合液2.9 mL，過氧化氫60 μL，作為對照；另1只中加入酶液50 μL，含有愈創木酚的反應混合液2.9 mL和過氧化氫60 μL,立即開啟秒表記錄時間，于分光光度計上測量波長470 nm處吸光度值，每隔1分鐘讀數1次。以每分鐘變化0.01為一個酶活性單位。1.3.3 反應時間對過氧化物酶的活性影響 按照“1.3.2”的測定方法,總反應體系分別反應1、2、3、4、5 min,測其吸光值。

1.3.4 pH對過氧化物酶活性的影響 配制pH值分別為5.29、5.59、5.91、6.24、6.47、6.64、6.81、6.98、7.17、7.38、7.73、8.04的磷酸緩沖液。按“1.3.2”的方法，在室溫下測定不同pH值的吸光值。

1.3.5 反應溫度對過氧化物酶活性的影響 按“1.3.2”方法建立反應體系,反應底物分別于20、30、40、50、60、70、80℃下預先保溫10 min,再加入粗酶液50 μL,在波長470 nm處測定吸光值。

1.3.6 過氧化物酶的熱穩定性研究 取等量粗酶液4份,在100℃水浴中分別熱燙5、10、15、30 s，取出后迅速冷卻，按“1.3.2”的方法測定不同熱燙時間的吸光值。

1.3.7 底物濃度對過氧化物酶活性的影響 分別配制濃度為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%的愈創木酚溶液為底物,按照“1.3.2”的測定方法,測其在最適溫度、最適pH值及酶液濃度保持固定條件下的吸光值，計算酶的活性。

1.3.8 不同炮制工藝對過氧化物酶活性的影響 探討水蒸氣、80℃熱風干燥、微波干燥、自然陰干四種炮制工藝，對過氧化物酶的活性抑制。按“1.3.1”“1.3.2”的方法，提取不同炮制工藝的粗酶液測定其吸光值。

1.3.9 總黃酮含量測定 取干燥菊花1 g，精密稱定，加入30 mL 60%甲醇于60℃水浴中溫浸1 h，直接加熱回流45 min,過濾，濾液定容至50 mL。精確取出1 mL,減壓濃縮至浸膏，用甲醇稀釋至50 mL容量瓶中定容，搖勻后得甲醇提取液。以試劑為空白，用3 cm比色皿于510 nm處測定吸光度值，依據標準曲線方程計算出不同干燥方法所得樣品中黃酮含量,分析不同炮制工藝干燥條件對黃酮的含量影響。標準曲線的建立：以蘆丁標樣進行總黃酮含量的測定，稱取蘆丁對照品制成濃度為0.148 0 mg/mL的標準溶液。按上述方法測定，分別移取標準樣品0～5.0 mL,標準曲線方程為：

Y(mg/mL)=0.084 2X-0.000 68,R2=0.989 1其中X為吸光值。

1.4 數據處理

所有數據均采用Microsoft Excel進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 菊花過氧化物酶反應進程曲線

由圖1可見，在反應初期，即2 min內，隨著反應的進行，OD值（產物生成量）呈直線上升，屬于反應初速度。因此,本實驗確定酶促反應時間以不超過2 min為宜。

2.2 pH對菊花過氧化物酶活性的影響

由圖2可見，過氧化物酶在pH值為6.8時，酶活性最高，表明該酶的最適pH值為6.8,當pH值為5.3和8.0時,過氧化物酶的活性分別為最大時的30%和55%。

圖1 POD反應進程曲線

圖2 pH對POD活性的影響

2.3 溫度對菊花過氧化物酶活性的影響

由圖3可以看出,36℃以下酶的活性逐漸升高, 36℃以上酶的活性逐漸降低。36℃吸光值達到峰值，酶的活性達到最高。當溫度達到70℃時，過氧化物酶的相對活性是13.2%,當溫度20℃時,過氧化物酶的相對活性是40.9%。

2.4 菊花過氧化物酶熱穩定性

由圖4可知,隨著處理時間的增加,過氧化物酶活性迅速下降。15 s時，殘存活性僅剩19.8%。30 s時，殘存活性近乎為零。

圖3 溫度對POD活性的影響

圖 4 POD的熱穩定性

2.5 菊花過氧化物酶酶促反應動力學

由圖5可以看出,當底物濃度較低時 (0.01根據%),反應速率與底物濃度的關系呈正比關系,表現為一級反應。隨著底物濃度的增加，反應速率不再按正比升高，反應表現為混合級反應。當底物濃度達到相當高時，底物濃度對反應速率影響變小，最后反應速率與底物濃度幾乎無關，反應達到最大速率（Vmax）,表現為零級反應。

Lineweaver-Burk雙例數作圖法方程式 1/V= Km/Vmax×1/[S]+1/Vmax,以1/V～1/[S]作圖，得出一直線，如圖6。得直線方程Y=0.004X+0.028,根據直線斜率和截距求得該反應的米氏常數Km=1.58×10-2mol/L,最大反應速率Vmax=14.278 U/min。動力學方程為V=14.278[S]/(0.015 8+[S])(U/min)擬和直線相關系數達到0.998,得到菊花的過氧化物酶的酶促反應動力學符合米氏方程。

圖5 底物濃度對POD活性的影響

圖6 POD酶促反應雙倒數曲線

2.6 不同炮制工藝對菊花過氧化物酶的活性影響

由圖7可見，水蒸氣蒸30 s,酶的活性完全被抑制。反應活性與反應時間呈近直線關系，表示該炮制工藝受熱均勻。

圖7 水蒸汽對POD活性的影響

由圖8可見80℃熱風干燥，酶的活性在加工6 h后完全被抑制，反應活性與反應時間呈曲線關系，表示該酶耐熱性高。

由圖9可見微波干燥，酶的活性在加工12 min后完全被抑制，反應活性與反應時間不成直線關系，表明該炮制工藝受熱不均勻。

由圖10可見自然陰干過程，酶的活性一直存在。反應活性與反應時間成曲線關系，表明該炮制工藝酶的活性不能得到抑制。

圖8 80℃熱風干燥對POD活性的影響

圖9 微波干燥對POD活性的影響

圖10 陰干干燥對POD活性的影響

2.7 不同炮制工藝干燥總黃酮含量比較

由圖11可見不同炮制工藝干燥總黃酮含量，蒸制干燥＞微波干燥＞80℃熱風干燥＞自然陰干。

圖11 不同炮制工藝對總黃酮含量的影響

3 結論與討論

過氧化物酶是植物體內普遍存在且活性較高的一種酶，該酶催化以H2O2為氧化劑的氧化還原反應，在氧化其他物質的同時，將H2O2還原為H2O，用以清除細胞內的H2O2，是植物體內的保護酶之一，此外過氧化物酶與植物的呼吸作用、光合作用、生長素的氧化以及木質素的形成等有關，其活性隨植物生長發育進程以及環境條件的改變而變化[14-15]。在H2O2存在下，它能催化酚類、從而導致組織褐變[14-17]。菊花過氧化物酶最適溫度36℃，最適pH7.0,最適底物濃度0.03%。菊花過氧化酶耐熱性高，80℃熱風干燥6 h,酶的活性才完全抑制。對熱敏感，100℃水蒸汽蒸，30 s酶活性則被鈍化。對于酶促褐變，在適宜溫度下，反應酶活性越強，對酶促褐變程度越高。在過氧化物酶活性測定系統中，以愈創木酚為底物的菊花過氧化物酶的Km=1.58×10-2mol/L。

通過紫外分光光度計測量顯示，蒸汽干燥總黃酮含量最高，多酚氧化酶的活性趨勢與黃酮含量有相關性，但仍需實驗證明。黃酮類物質是菊花的主要成分之一，炮制工藝中微波干燥菊花受熱不均勻[18-19]，硫熏工藝在農產品及中藥飲片加工中都是不推薦的[19-20]，因此菊花的炮制工藝可通過閃速高溫滅酶來抑制菊花酶促褐變。

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（本文編輯 楊 瑛）

Study on Characters of Peroxidase in Chinese Medicine Chrysanthemum and its Processing Technology

SU Jing1,LIU Shoujing1*,ZHU Jingjing2,ZHU Yuyun1,2
(1.Anhui University of Chinese Medicine,Hefei,Anhui 230000,China; 2.Institute of Chinese Materia Medica,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China)

Objective To observe the peroxidase(POD)character and processing technology of chrysanthemum.Methods The enzymatic characteristics of POD from chrysanthemum were investigated by spectrophotometry,with the guaiacol as substrate.The POD and total flavonoid content under different processing technology were compared.Results The reaction time for POD should not exceed 2 min,the optimum pH and temperature of POD were 7.0 and 36℃,respectively.The POD activity was completely inactivated when it was incubated at 100℃ for 30s.The reaction kinetic of enzymatic browning was accordant withkinetic parameters.The Km and Vmax were 1.58×10-2mol/L,14.278 U/min,respectively.Four processing methods show different effects on POD activity,and their inhibitory capacity was steaming drying＞microwave drying＞ 80 ℃ hot air drying＞natural shade drying.Conclusion The POD in chrysanthemum has a wide range of adapting temperature,20～80℃, and good relative thermal stability.This research can provide reference for the processing technology of chrysanthemum.

chrysanthemum;peroxidase;enzymatic characteristics;processing technology;flavonoids

R283

B

10.3969/j.issn.1674-070X.2017.03.007

2016-01-02

國家自然科學基金面上項目(81373960,81573600)；國家中醫藥管理局行業專項(201307008-04)。

蘇 靖，女，碩士研究生，研究方向：藥用植物學與中藥資源化學。

*劉守金，男，教授，博士研究生導師,E-mail:shjiuliu@sina.com。

本文引用：蘇 靖，劉守金，朱晶晶，朱玉蕓.中藥菊花過氧化物酶酶學特性及炮制工藝的研究[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（3）：259-263.