不同時辰艾灸對急性胃黏膜損傷模型大鼠EGF及TGF-α的影響

尹秀婷，張 泓*，張 健，許 明，劉寄生，林居財(.湖南中醫藥大學研究生院，湖南 長沙 4008；.湖南中醫藥大學康復教研室，湖南 長沙 4008）

不同時辰艾灸對急性胃黏膜損傷模型大鼠EGF及TGF-α的影響

尹秀婷1，張 泓2*，張 健1，許 明1，劉寄生1，林居財2
(1.湖南中醫藥大學研究生院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學康復教研室，湖南 長沙 410208）

目的 觀察不同時辰艾灸對急性胃黏膜損傷模型大鼠表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）及轉化生長因子-α(transforming growth factor-α，TGF-α)的影響，探討不同時辰艾灸對大鼠急性胃黏膜損傷修復是否存在差異，期以闡述施灸時機對艾灸療效的影響。方法 40只SD大鼠隨機分為空白組（A）、模型組（B）、辰時艾灸組（C）、未時艾灸組（D）、戌時艾灸組（E），每組8只，除A組以外，采用無水乙醇灌胃法將其余大鼠制備成急性胃黏膜損傷模型，其中A組、B組不予施灸;余三組選用兩組穴位:（1）“足三里”(雙)“中脘”;（2）“脾俞”(雙)“胃俞”(雙)施溫和灸20 min。各組予以相應處理7 d后，取胃組織肉眼下觀察胃黏膜損傷指數（UI），Elisa法檢測胃黏膜組織中EGF、TGF-α的含量。結果 （1）相比于A組，其余各組UI值明顯提高(P＜0.01)；相比于B組，各艾灸組UI值明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)；艾灸組之間比較，C組、E組UI值低于D組(P＜0.05)。（2）與B組相比，各艾灸組胃黏膜EGF、TGF-α含量顯著增加(P＜0.05或P＜0.01)；艾灸組之間比較，C組胃黏膜EGF、TGF-α的含量高于D組、E組(P＜0.05)。結論 （1）不同時辰艾灸“足三里”“中脘”“脾俞”“胃俞”對大鼠急性胃黏膜損傷具有一定的修復作用，可能是通過提高胃黏膜中EGF、TGF-α的表達發揮修復作用的；（2）以辰時艾灸組療效最優，提示辰時艾灸存在相對特異性，部分證實施灸時機對艾灸效應的影響。

時辰；急性胃黏膜損傷；艾灸；表皮生長因子；轉化生長因子-α

急性胃黏膜損傷是多種胃疾病的始動環節[1]，是消化系統的最常見病變之一。大量的臨床實踐和實驗研究已證實針灸有保護和促進胃黏膜損傷修復的作用[2]。前期研究表明[3-4]，常規針刺基礎上結合子午流注針法對胃黏膜損傷修復的療效更優，提示針刺時機是影響療效的重要因素。本項目從時辰是影響艾灸療效因素的假說為切入點，以急性胃黏膜損傷模型大鼠為研究對象，通過觀察胃黏膜損傷指數 (ulcer index,UI)與表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、轉化生長因子-α(transforming growth factor-α，TGF-α)的水平表達，探討不同時辰艾灸治療效應是否存在差異，以進一步闡述施灸時機對艾灸療效的影響，期為臨床艾灸治療胃黏膜損傷性疾病及擇時艾灸以提高臨床療效提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

40只，雌雄各半，10～12周齡，體質量200～250 g，健康Sprague-Dawley大鼠，SPF級，飼養溫度20～25℃，濕度50%～70%，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供[動物許可證號:SCXK(湘)2013-0004]。大鼠適應性喂養1周后用于本實驗，40只大鼠按隨機數字表法為空白組（A）、模型組（B）、辰時艾灸組（C）、未時艾灸組（D）、戌時艾灸組（E），每組8只。實驗過程中對動物的處置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》[5]相關動物倫理學標準的條例。

1.2 主要試劑與儀器

艾條:李時珍蘄艾條微煙艾條（規格：4 mm×10 cm, 100支/盒）；自制艾灸架:用于固定艾條；隔熱材料:薄紙板，再在此板上打一個直徑為3 mm的小孔，用于暴露穴位處皮膚；16號灌胃針；EGF、TGF-α酶聯免疫ELISA試劑盒，TGL-16臺式高速冷凍離心機(長沙科威實業有限公司)；AEU-210電子分析天平(長沙湘儀天平儀器廠)；PW-812全自動酶標洗板機（濟南安暢醫療設備有限公司）；MB-530酶標儀（濟南安暢醫療設備有限公司）；THZ-C恒溫振蕩器（長沙強樂有限公司）；Motic B 1顯微鏡(福建麥克奧迪實業集團有限公司)；OLYMPUS Bx-70顯微鏡成像系統 (日本OLYMPUS公司)；圖像分析軟件Image Pro-Plus(美國Media Cybernetics公司)；石蠟切片機(美國820型AO切片機)；10%水合氯醛；0.9%生理鹽水；95%乙醇；10%中性福爾馬林溶液。

1.3 造模方法

空白組大鼠以生理鹽水(0.6 mL/100 g)灌胃，同時其余各組大鼠以95%無水乙醇灌胃 (0.6 mL/ 100 g)制備成急性胃黏膜損傷大鼠模型。急性胃黏膜損傷大鼠模型造模成功標準[6]:（1）肉眼可見模型組胃體前壁黏膜層見缺損狀病灶,周圍充血水腫,黏膜表面附有出血,胃體部見多處出血、糜爛;（2）在光鏡下模型組大鼠胃黏膜出現明顯破損、脫落、出血、水腫,黏膜下可見炎癥細胞浸潤。

1.4 治療方法

穴位定位參照李忠仁主編的“十一五”國家級規劃教材《實驗針灸學》[7]大鼠標準穴位圖譜定位并模擬人體骨度分寸法量取，以胸鎖聯合和恥骨聯合連線下1/4與上3/4交點為肚臍。足三里：膝關節后外側，腓骨小頭下約5 mm處；中脘：臍與胸骨劍突連線中點，約臍上20 mm處；脾俞：第十二胸椎下，旁開5 mm；胃俞：第十三胸椎下，旁開5 mm。艾灸方法：從急性胃黏膜損傷模型造模后的第1天開始，A組、B組大鼠不予施灸;每天捆綁縛于鼠板約20 min;C組（7:00—9:00）、D組（13:00—15:00)、E組（19:00—21:00）大鼠捆縛固定于鼠板上施灸，選用兩組穴位:（1）“足三里”(雙)、“中脘”;（2）“脾俞”(雙)、“胃俞”(雙)，兩組穴每天交替進行。定穴后局部剪毛，用透明膠布把隔熱紙板粘貼覆蓋大鼠局部，自制艾灸架用于固定艾條，使艾條垂直距離大鼠穴位體表2～3 cm，點燃施灸，并隨時調整艾條與穴位之間的距離，施灸前用體表溫度計測量大鼠表皮溫度，灸后復測大鼠表皮溫度，以便觀察記錄。每日1次，每次每穴（點）灸20 min，共7 d。

1.5 觀察指標及檢測方法

治療結束后第二天將各組大鼠用10%水合氯醛以（3.5 mL/kg）腹腔麻醉。將胃的幽門部和賁門部分別用結扎線結扎，在兩結扎線的兩端切斷食道及十二指腸，摘下全胃。沿胃大彎剖開，用冰生理鹽水沖洗，放在冰塊上用10倍放大鏡肉眼觀察大鼠的胃黏膜損傷情況，參照Guth法[8-9]計算UI值。Guth法的計算標準是:斑點糜爛計1分；糜爛長度＜1 mm計2分；糜爛長度1～2 mm計3分；糜爛長度2～3 mm 計4分；糜爛長度＞4 mm計5分；寬度＞1 mm時分值×2。取胃組織一小塊(5 mm×10 mm)，然后放入40 g/L多聚甲醛中4℃固定，用于HE染色，另取一小塊(10 mm×10 mm)入氮液凍存于-80℃冰箱，用于Elisa法檢測EGF及TGF-α的表達。

EGF、TGF-α的含量測定:嚴格按酶聯免疫EGF、TGF-α試劑盒說明書進行操作。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠胃黏膜損傷指數比較

由表1可見，與A組相比，其余各組UI值顯著升高(P＜0.01)，說明無水乙醇灌胃導致胃黏膜損傷，造模成功;C組、D組、E組UI值明顯低于B組 (P＜0.05或P＜0.01)，說明艾灸能明顯降低胃黏膜損傷指數，對胃黏膜有修復作用；與D組相比，C組、E組UI值呈降低趨勢(P＜0.05);C組UI值稍低于E組，差異無統計學意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠UI值的比較 (±s，分)

表1 各組大鼠UI值的比較 (±s，分)

注：與A組比較，**P＜0.01；與B組比較，▲▲P＜0.01,▲P＜0.05；與D組相比，◆P＜0.05。

2.2 艾灸對急性胃黏膜損傷大鼠胃黏膜 EGF、TGF-α含量的影響

從表2中可知，相比于A組，其余各組胃黏膜EGF、TGF-α含量升高(P＜0.05或P＜0.01)，表明無水乙醇灌胃后，胃黏膜損傷周圍EGF、TGF-α表達增強；相比于B組，各艾灸組胃黏膜EGF、TGF-α含量明顯增加(P＜0.05或P＜0.01)；三個不同時辰艾灸組之間比較，C組胃黏膜EGF、TGF-α的含量高于D組、E組(P＜0.05)。表明不同時辰艾灸能提高大鼠急性胃黏膜損傷EGF、TGF-α的含量，且以辰時艾灸效果最佳。

表2 各組大鼠胃黏膜中EGF、TGF-α含量比較 (±s,n=8，μg/μL)

表2 各組大鼠胃黏膜中EGF、TGF-α含量比較 (±s,n=8，μg/μL)

注：與A組比較，**P＜0.01,*P＜0.05；與B組比較，▲▲P＜0.01,▲P＜0.05；與D組比較，◆◆P＜0.01，◆P＜0.05；與E組比較，●P＜0.05。

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3 討論

急性胃黏膜損傷 （acute gastric mucosal lesion, AGML）是指由于嚴重創傷、藥物、酒精或辛辣飲食等應激性因素所導致的一種急性胃黏膜病變，它以胃黏膜的糜爛、潰瘍甚至出血為主要特征，是消化系統最常見的一種病理變化。它屬于中醫學中的“胃脘痛”范疇，其病位在脾胃，與足陽明經密切相關,氣血循環中足陽明胃經是多氣多血之經，是臨床上治療胃腑病證的首選經脈。針灸治療胃黏膜損傷性疾病，俞募配穴和下合穴是常用的取穴方法，胃之下合穴(足三里)，脾之背俞穴(脾俞)，胃之背俞穴(胃俞)和胃之募穴(中脘)這4個穴位是針灸治療胃黏膜損傷性疾病使用頻率最高的主要穴位[10～12]。艾灸療法作為一種溫熱良性刺激原，具有溫熱、溫補、溫通的作用，在促進胃黏膜損傷后修復、防治胃潰瘍性疾病等方面，具有較高的臨床應用價值。

EGF能促進胃黏膜上皮細胞DNA合成、分裂及細胞增殖，具有很強的抑制胃酸分泌作用[13]。TGF-α是維持黏膜完整性的重要介質,它參與內皮結構重建，促進上皮細胞增殖及黏液生成，增加胃黏膜微循環，在受損胃黏膜修復及維持完整性中起重要作用[14]。艾灸可通過提高胃組織表皮生長因子、轉化生長因子的表達，兩者均結合EGFR，激活后的EGFR介導ERK磷酸化從而激活EGFR/ERK信號傳導通路，因而起到保護胃黏膜、促進胃黏膜增殖修復的作用[15]。本實驗研究結果顯示不同時辰艾灸“足三里”“中脘”“脾俞”“胃俞”均能提高胃黏膜中EGF、TGF-α的表達水平,說明不同時辰艾灸“足三里”“中脘”“脾俞”“胃俞”對大鼠急性胃黏膜損傷都有一定的修復作用，一定程度上是通過提高胃組織EGF、TGF-α的表達發揮作用的。其中以辰時艾灸組對急性胃黏膜損傷修復作用最強，表明施灸時機對艾灸效應的影響，提示時辰可能是影響艾灸效應的內在機制之一。

子午流注法是把時間因素和針灸施治緊密結合在一起，著重以擇時作為針灸施治的主要條件，認為不同時辰機體氣血盛衰狀況不同，針灸效應也不同。《素問·針解》說:“補瀉之時,與氣開闔相合也。”血氣應時而至為盛，血氣過時而去為衰，逢時而開，過時為闔。子午流注中“開”是指開放、宣通的意思，經氣流注相應臟腑時，刺激與該臟腑密切相關的腧穴可使氣血宣通暢達而達到治療目的。子午流注納支法中與胃腑相對應的時辰為“辰”時，此時氣血流經相應的經脈臟腑，氣血大盛，故選取與胃腑密切相關腧穴灸之，達到最佳治療效應。考慮到大鼠是晝伏夜行動物，一般認為與人的生理節律相反，所以設置了“辰”時的對應時辰“戌”時作為對照時辰進行觀察。至于選擇“未”時作為對照觀察時間點是因為“未”時為“辰”時和“戌”時的中間點。本實驗結果證實“辰”時的艾灸治療效應優于其它兩組，印證了“謹候其時，病可與期，失時反候者，百病不治”(《靈樞·衛氣行篇》)的經典論述。也表明“辰”時艾灸對急性胃黏膜損傷的修復具有相對的時辰特異性，說明了施灸時機對艾灸療效有著較為重要的作用，值得臨床重視。至于“戌時”效應相對較差是否與實驗過程中人為的打亂了動物的生理節律有關亦或大鼠的生理節律本來就與人類相一致值得進一步研究。

綜上所述，本研究表明（1）不同時辰艾灸“足三里”“中脘”“脾俞”“胃俞”對大鼠急性胃黏膜損傷具有一定的修復作用，可能是通過提高胃黏膜中EGF、TGF-α的表達發揮修復作用的；（2）以辰時艾灸組療效最優，提示辰時艾灸存在相對特異性，部分證實施灸時機對艾灸效應的影響，其具體內涵仍需進一步研究。

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（本文編輯 匡靜之）

Effects of Different Time Moxibustion on EGF and TGF-α in Acute Gastric Mucosal Lesion Model Rats

YIN Xiuting1,ZHANG Hong2*,ZHANG Jian1,XU Ming1,LIU Jisheng1,LIN Jucai2
(1．Graduate School of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.Department of Rehabilitation, Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To observe the effect of different time moxibustion on EGF and TGF-α contents in acute gastric mucosal lesion model rats,and to investigate whether differences exsit in different time moxibustion on acute stomach membrane damage repair.To elabrate the effect of moxibustion at different time.Methods 40 SD rats were randonly divided into the control group(group A),model group(group B),moxibution at 7 a.m to 9 a.m group（group C),moxibution at 1 p.m to 3 p.m group (group D),moxibution at 7 p.m to 9 p.m group (group E),eight rats in each group. The gastric mucosal injury rats models besides group A were built by intragastric administration of absolute alcohol.Group A and B were not given moxibustion.The other three groups were treated with mild moxibustion for 20 min at two sets of acupoints,(1)"Zusanli"(two),"Zhongwan",(2)"Pishu"(two),"Weishu"(two).After treatment for 7 d,the UI(gastric mucosal injury index)of gastric tissue was observed under naked eyes.The EGF and TGF-α in gastric tissue were determined by Elisa.Results(1)Compared with group A,the UI index in other groups increased significantly(P＜0.01).Compared with group B,UI index in other groups decreased markedly (P＜0.01 or P＜0.05).The UI of group C and group E was lower than that of group D(P＜0.05).(2)Compared with group B,EGF and TGF-α in the groups increased significantly(P＜0.01 or P＜0.05),while the EGF and TGF-α in group C were higher than that in group D and group E (P＜0.05).Conclusion (1)Different time moxibustion at"Zusanli""Zhongwan""Pishu"and"Weishu"have repairing effect on acute gastric mucosal injury rats,its repairing effect was probably played by up-regulating EGF and TGF-α protein expression. (2)The moxibution at the day of from 7 a.m to 9 a.m shows strongest effect on acute acute gastric mucosal lesion,which demonstrate that there is a relative specificity of different time moxibustion on the effect of moxibustion,partially confirm time on moxibustion effect.

time;acute gastric mucosal lesions;moxibustion;EGF;TGF-α

R245.81

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.03.017

2016-11-13

國家自然科學基金（85010001031）；湖南省研究生科研創新課題項目（0141-090100200311）。

尹秀婷，女，在讀碩士研究生，主要研究方向：針灸治病機理研究 。

*張 泓，男，教授 ，博士研究生導師，E-mail:zh5381271@sina.com。

本文引用：尹秀婷，張 泓，張 健，許 明，劉寄生，林居財.不同時辰艾灸對急性胃黏膜損傷模型大鼠EGF及TGF-α的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（3）：294-297.