雙孢蘑菇固態發酵對燕麥多酚的影響

劉紅艷，翟飛紅，馬茹男，韓建榮

（山西大學生命科學學院，山西太原030006）

雙孢蘑菇固態發酵對燕麥多酚的影響

劉紅艷，翟飛紅，馬茹男，韓建榮

（山西大學生命科學學院，山西太原030006）

初步研究了雙孢蘑菇固態發酵對燕麥中游離態多酚和結合態多酚含量的影響，并采用高效液相色譜法測定了酚酸種類的變化。結果表明，燕麥經雙孢蘑菇固態發酵后，游離態多酚含量從0.015 mg/g提高到5.782 mg/g，是對照的385.5倍；結合態多酚含量由0.335 mg/g減少到0.156 mg/g，是對照的46.6%；總酚含量由0.350 mg/g增加到5.938 mg/g，是對照的16.966倍。高效液相色譜法測定結果表明，經雙孢蘑菇發酵后，燕麥中的酚酸種類發生了變化，且種類明顯多于對照組，其中，對照組中綠原酸含量（25.43%）豐富，而發酵后的燕麥中咖啡酸含量（16.79%）豐富。

雙孢蘑菇；燕麥；固態發酵；多酚

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）在分類學上屬擔子菌類傘菌目傘菌科，其具有很高的營養價值[1]。研究發現，雙孢蘑菇具有降低血脂、護肝、抗氧化、防癌抗癌和抑菌等廣泛的藥理作用[2]。對于雙孢蘑菇，不僅其子實體可以被利用，其菌絲體也可以通過固態發酵等方式加以利用。

燕麥的主要成分為淀粉和蛋白質，具有多元酚結構的酚類物質也廣泛存在于燕麥中，其多酚類物質不僅具有很強的清除自由基能力，還可以通過抑制氧化酶和絡合過渡金屬離子等方式起到抗氧化作用[3-4]。有報道表明，燕麥中的多酚主要以結合態和游離態形式存在，并且結合態多酚含量遠遠高于游離態多酚含量[5]。結合態多酚主要分布在皮層和糊粉層，人們在食用燕麥的過程中，結合態多酚往往不能被人體充分吸收，從而降低了對燕麥多酚的利用率。

大量研究表明，經微生物發酵以后，谷物中的大分子物質能被降解成利于人體吸收的小分子物質，提高其營養物質的利用率[6]。但關于雙孢蘑菇利用燕麥進行固態發酵的研究還未見報道。

本試驗選用燕麥作為培養基，初步研究了雙孢蘑菇固態發酵對燕麥多酚含量的影響，并對發酵后多酚的成分進行了初步鑒定，旨在為提高谷物營養價值提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 菌種

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）2796菌株，由山西大學生命科學學院微生物實驗室提供，保存于馬糞瓊脂培養基中。

1.2 試劑

沒食子酸、福林酚、3，5-二硝基水楊酸（DNS）、甲醇、濃鹽酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯、碳酸鈉、酒石酸甲鈉、石油醚、可溶性淀粉，均為國產分析純；原兒茶酸、龍膽酸、咖啡酸、綠原酸、對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、p-香豆酸、阿魏酸、芥子酸、水楊酸、肉桂酸，均為高效液相色譜純。

1.3 儀器

TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；電子天平，上海精密科學儀器有限公司；SC-3614低速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；臺式全溫振蕩培養箱，上海知楚儀器有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；GZX-9076MBE電熱鼓風干燥箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；RE-52AA旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；Waters高效液相色譜儀配Waters 2487泵和Waters 2526紫外檢測器，上海鉑力生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 燕麥培養基的制備 準確稱取800 g（干質量）除去谷殼和石子等雜物的燕麥，在100℃沸水中煮沸至無白心，瀝干水分，攤開晾干至不黏手（水分含量大約為40%）。然后，將處理好的燕麥平均分裝在16個250 mL的錐形瓶中，用透氣塑料膜封口，121℃滅菌1 h。

1.4.2 固態發酵 將活化后的雙孢蘑菇斜面菌種切成1 cm×1 cm的小塊，接種至滅菌后的燕麥培養基中，每瓶接種3塊，置于25℃培養箱中培養，待菌絲長滿瓶后開始計時，分別在滿瓶后第5，10，15，20，30天后取出。取出的樣品用玻璃棒攪拌均勻，部分用來直接測定碳水化合物水解酶的酶活；部分在40℃烘箱中烘干并粉碎過0.177 mm篩，用來測定發酵產物的多酚含量及組成。每個處理做3個重復，以不接種的培養基作為對照。

1.4.3 發酵產物多酚的提取

1.4.3.1 游離態多酚的提取 按照CHETHAN等[7]的方法，略作改動。分別準確稱取5 g烘干并粉碎的樣品，用石油醚（30～60）脫脂，加入50 mL 1%HCl-甲醇提取劑，在搖床上振蕩提取24 h（25℃，150 r/ min）。然后，4 000 r/min離心10 min，取上清。采用相同方法重復提取2次，并合并上清液。將所得提取液45℃旋轉蒸發至干，并用甲醇定容至一定體積，即為游離態多酚提取液。

1.4.3.2 結合態多酚的提取 將1.4.3.1所得殘渣40℃烘干后加入20 mL NaOH溶液（2 mol/L），25℃搖床150 r/min振蕩1 h，然后用濃HCl調pH值至2，加入15 mL乙酸乙酯，靜置10 min，4 000 r/min離心6 min，收集乙酸乙酯部分，45℃旋轉蒸發至干，最后用甲醇定容至10 mL，即為結合態多酚提取液。

1.5 測定項目及方法

1.5.1 發酵產物多酚含量的測定 采用Folin-Ciocalteu比色法[8]測定多酚的含量。標準曲線的繪制采用沒食子酸，根據沒食子酸的濃度和OD值來繪制標準曲線，得到的標準曲線的線性回歸方程為：y＝7.157 5x－0.003 5（R2＝0.999 8）。多酚含量以mg沒食子酸/g燕麥（干質量）來表示（文中單位均表示為mg/g）。

1.5.2 發酵產物多酚種類的測定 采用HPLC法測定發酵后燕麥中游離態多酚的組成成分。具體HPLC條件等參考CHETHAN等[7]的方法，高效液相系統：Waters 1525泵、Waters 2487雙波長吸收檢測器，用C18反相色譜柱（Venusil XBP C18（L）5 μm，150?，250 mm×4.6 mm），紫外檢測波長295 nm，樣品過0.45μm的濾器，進樣量20μL，流速1.0 mL/min，柱溫為25℃；色譜條件：流動相A為0.01%的乙酸，流動相B為甲醇（色譜純）。洗脫梯度程序：0 min（80%A＋20%B），0～40 min（60%A＋40%B），40～50 min（60%A＋40%B），50～55 min（80%A＋20%B），55～65 min（80%A＋20%B）。

樣品色譜圖出峰時間與標準品出峰時間作比較，分析對照組與發酵后燕麥中游離態多酚種類的變化。

1.6 統計學分析

數據用SPSS 18.0軟件Duncan多重比較法[9]進行多個均值間的兩兩比較。

2 結果與分析

2.1 發酵產物多酚的含量

從圖1可以看出，燕麥經雙孢蘑菇固態發酵后，隨著發酵時間的延長，游離態多酚含量逐漸增加，結合態多酚含量逐漸減少，總酚含量逐漸增加。未經雙孢蘑菇固態發酵的燕麥，游離態多酚含量為0.015 mg/g，結合態多酚含量為0.335 mg/g，結合態多酚含量遠高于游離態多酚含量，且結合態多酚含量為游離態多酚含量的22倍；當發酵時間為30 d時，游離態多酚含量達最高值，為5.782 mg/g，結合態多酚含量達到最少值，為0.156 mg/g，總酚含量為5.938 mg/g，其中，游離態多酚含量是對照的385.5倍，結合態多酚含量是對照的46.6%，總酚含量是對照的16.966倍。

2.2 發酵產物多酚種類的測定

選取12種谷物中最常見的酚酸作為標準品，進行HPLC分析，其色譜圖如圖2所示。

如圖3所示，通過和圖2中的12種標準品色譜出峰時間進行對比，對照組燕麥中的游離態多酚的HPLC圖譜中有5種峰可以被確定，分別為綠原酸、對羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸和肉桂酸。由表1可知，對照組燕麥中，綠原酸的峰面積占總酚峰面積的比例最大（25.43%），即對照組燕麥中的綠原酸含量較豐富。

表1 發酵前后燕麥不同種類酚酸的相對峰面積 %

如圖4所示，發酵后燕麥中的游離態多酚的HPLC圖譜出峰數明顯多于對照組，與圖2中的12種標準品出峰時間比對發現，有7種峰可以被確定，除了對照組中的對羥基苯甲酸和香草酸之外，還檢測出了原兒茶酸、咖啡酸、p-香豆酸、芥子酸和龍膽酸。由表1可知，發酵后的燕麥中，咖啡酸的峰面積占總酚峰面積的比例最大（16.79%），即發酵后的燕麥中咖啡酸含量較豐富。

結合圖3，4可以看出，經雙孢蘑菇固態發酵后，對照組中的綠原酸、阿魏酸和肉桂酸并未檢測出，檢測出了新的龍膽酸、咖啡酸、p-香豆酸和芥子酸。猜想可能在發酵過程中發生了某些生物化學反應，使燕麥中游離態多酚的種類發生了變化。此外，表1結果表明，經雙孢蘑菇固態發酵后，燕麥中各酚酸的比例也發生了變化，如對照組中的香草酸僅為0.32%，經雙孢蘑菇發酵后，其比例變為2.59%。結果表明，雙孢蘑菇固態發酵不僅提高了燕麥的多酚含量，也增多了酚酸的種類，而且各酚酸的比例也得到了改變。從圖3，4還可以看出，對照組和發酵后的HLPC色譜圖中，仍有很多含量很高卻無法被確定的酚酸存在，所以，下一步將采用高效液相分步收集各組分，并采用核磁共振結合高效液相-質譜聯用技術來分析這些發酵后產生的未知新物質。

3 結論與討論

本研究結果表明，燕麥經雙孢蘑菇固態發酵后，隨著發酵時間的延長，游離態多酚含量逐漸增加，結合態多酚含量逐漸減少，總酚含量逐漸增加。經雙孢蘑菇固態發酵后，燕麥的游離態多酚含量增加了5.767 mg/g，而其結合態多酚含量僅降低了0.179 mg/g，表明其游離態多酚含量的增加要遠高于結合態多酚含量的減少。LIU等[10]研究結果表明，雙孢蘑菇的子實體中富含多酚，且其多酚含量會受到栽培條件和周圍環境等的影響。在固態發酵過程中，雙孢蘑菇代謝會產生多酚，使得燕麥發酵產物中的游離態多酚含量提高。

目前，BHANJA等[11]用2種絲狀真菌米曲霉（Aspergillus oryzae）和泡盛曲霉（Aspergillus awamori）來發酵小麥，研究了發酵后小麥的總酚含量和抗氧化性，結果表明，小麥經這2種絲狀真菌固態發酵后總酚含量及抗氧化性顯著提高，其中，總酚含量從未發酵時的7.226 μmol/g提高到158.192 μmol/g；此外，還對發酵體系中的α-淀粉酶、β-葡糖苷酶和纖維素酶等碳水化合物水解酶的酶活進行了測定，并對這些酶活與多酚含量之間的相關性進行了分析，結果表明，碳水化合物水解酶的酶活與多酚含量之間有一定的正相關性，表明碳水化合物水解酶在釋放結合態多酚中起到了一定的作用。雙孢蘑菇可以分泌一些碳水化合物水解酶來分解大分子物質，以提供生長過程中所需的能量[12]。在本試驗中，發酵后燕麥中結合態多酚含量的減少，可能是由于碳水化合物水解酶引起了結合態多酚釋放。MOORE等[13]使用酵母發酵麥麩，研究發現，麥麩中的酚酸及總酚含量顯著增加，其清除自由基能力明顯提高。LEE等[14]用各種安全的絲狀真菌，包括泡盛曲霉（A.awamori）、米曲霉（A.oryzae）、醬油曲霉（Aspergillus sojae）和根曲霉（Rhizopus azygosporus）等發酵黑豆，研究發酵前后黑豆抗氧化能力的變化，結果表明，發酵后黑豆中多酚含量顯著上升，抗氧化能力得到改善。表明豆類經絲狀真菌或酵母類真菌固態發酵后，其多酚含量和抗氧化作用都有了顯著提高。本試驗結果也表明，利用雙孢蘑菇固態發酵后，多酚含量得到了顯著提高。

雙孢蘑菇子實體也具有治療高血壓和肝炎等功效[15]，很多研究表明，雙孢蘑菇子實體與菌絲體具有相同的功效，并且有的菌絲體要優于子實體。翟飛紅等[16]利用雙孢蘑菇菌絲體進行液態發酵，對所得到的菌絲體的抗氧化性和多糖含量進行分析，結果表明，雙孢蘑菇菌絲體具有很強的抗氧化活性，且含有豐富的多糖。可能是由于固態發酵過程中會發生很多生物化學變化，會分泌一些有益的小分子物質，除此之外，微生物中含有豐富的酶系，在發酵過程中會產生新的代謝產物[6]。

一般固態發酵都會采用酵母菌如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和泡盛曲霉（A.awamori）、米曲霉（A.oryzae）及根曲霉（R.azygosporus）等霉菌，利用食用真菌對谷物進行固態發酵，研究的人還很少。所以，在研究雙孢蘑菇固態發酵對多酚含量影響的情況下，其抗氧化作用還有待研究，并對其發酵后產生的其他營養物質進行深入分析。

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Effect of Solid-state Fermentation of Agaricus bisporus on Polyphenols Content of Oats

LIUHongyan，ZHAI Feihong，MARunan，HANJianrong

（College ofLife Science，Shanxi Univeisity，Taiyuan 030006，China）

In this paper,the effect of solid-state fermentation with Agaricus bisporus on free polyphenol and bound polyphenol of oats were studied.The polyphenol species and the three kinds of hydrolytic enzymes（α-amylase,β-glucosidase and xylanase）were measured.The results showed that the contents of free polyphenol and total phenols increased after solid-state fermentation and varied with the prolonging of fermentation time.The contents of free polyphenol increased from 0.015 mg/g to 5.782 mg/g and the contents of total phenols increased from 0.350 mg/g to 5.938 mg/g,while the bound polyphenol content of fermentation products decreased from 0.335 mg/g to 0.156 mg/g.The results of HPLC indicated that the kinds of phenolic acid had a great change after fermentation.The chlorogenic acid（25.43%）in non-fermented oats and the caffeic acid（16.79%）in fermentation products was abundant,respectively.

Agaricus bisporus;oats;solid-state fermentation;polyphenol

S646.1＋1

A

1002-2481（2017）03-0361-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.03.11

2016-11-03

山西省煤基重點科技攻關項目（FT2014-03-15）

劉紅艷（1990-），女，山西交城人，在讀碩士，研究方向：資源微生物。韓建榮為通信作者。