不同基因型煙草的細(xì)胞毒性與致突變性分析

張永健，魏克強(qiáng)，楊進(jìn)文

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

不同基因型煙草的細(xì)胞毒性與致突變性分析

張永健1，魏克強(qiáng)1，楊進(jìn)文2

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

為了解不同基因型煙草的毒理學(xué)效應(yīng)，分別采用中性紅試驗(yàn)和Ames試驗(yàn)分析比較3個(gè)遠(yuǎn)緣雜交品系GZY-4，GZY-6，GZY-9和1個(gè)主栽烤煙品種NDY-1的煙霧提取物（CSE）對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO）和鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株的細(xì)胞毒性與致突變性。結(jié)果顯示，與NDY-1相比，GZY-4，GZY-6和GZY-9誘導(dǎo)的CHO存活率較高，其中，GZY-4和GZY-6的EC50顯著增大（P＜0.05），4個(gè)材料的細(xì)胞毒性大小依次為NDY-1＞GZY-9＞GZY-6＞GZY-4。CSE加S9后的致突變性明顯高于不加S9的致突變性；與NDY-1相比，GZY-4和GZY-9均降低了CSE的移碼突變和堿基置換能力，但GZY-6降低致突變的作用尤為顯著（P＜0.05）；不同雜交品系的CSE致突變性也存在一定的差異。通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)對(duì)煙草進(jìn)行遺傳改良，對(duì)提高煙草的安全性與可用性具有重要的意義。

煙草；煙霧提取物；細(xì)胞毒性；致突變性

煙草（N.tobacum）是重要的經(jīng)濟(jì)作物，然而，吸煙有害健康，世界煙草業(yè)正面臨著巨大的挑戰(zhàn)。長(zhǎng)期以來(lái)，世界各國(guó)致力于研制“低毒少害，相對(duì)安全”的卷煙制品[1]。研究表明，煙草通過(guò)燃燒、裂解、蒸餾、冷凝等一系列復(fù)雜的物理化學(xué)過(guò)程，形成的煙霧氣溶膠含有4 800余種化學(xué)成分，其中，既有提供香氣、吃味和生理作用的物質(zhì)，也有產(chǎn)生雜氣、刺激的物質(zhì)，還有苯并芘、亞硝胺、煙堿等有害的物質(zhì)[2-4]。煙草化學(xué)成分的形成與生態(tài)環(huán)境、品種類型、栽培技術(shù)等多種因素密切相關(guān)[5-6]。不同基因型煙草品種的化學(xué)成分存在較大的差異，直接影響了卷煙制品的安全性和可用性，培育低毒少害的品種已成為當(dāng)前我國(guó)煙草育種的主攻方向[7-8]。

煙草化學(xué)成分的差異會(huì)導(dǎo)致釋放的煙霧產(chǎn)生不同的毒理學(xué)效應(yīng)[9]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)卷煙制品的毒理學(xué)研究，通常采用國(guó)際煙草科學(xué)研究合作中心（CORESTA）推薦的體外毒性測(cè)試方法，即以哺乳動(dòng)物細(xì)胞系細(xì)胞毒性分析（中性紅試驗(yàn)）和細(xì)菌誘變分析（Ames試驗(yàn)）來(lái)評(píng)價(jià)煙氣部分化學(xué)成分（主流煙氣粒相凝集物）的相對(duì)毒性[10]。比較不同基因型煙草的體外毒性對(duì)優(yōu)良品種的選育具有重要的指導(dǎo)意義。

本研究以GZY-4，GZY-6和GZY-9等3個(gè)遠(yuǎn)緣雜交品系為材料，以主栽烤煙品種NDY-1為對(duì)照，分析其煙霧提取物（CSE）的細(xì)胞毒性與致突變性，旨在為煙草品種的遺傳改良提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

GZY-4，GZY-6和GZY-9為煙草遠(yuǎn)緣雜交品系，NDY-1為煙草栽培品種[11]，均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草育種研究室提供，測(cè)試所用的單料煙由山西昆明煙草有限責(zé)任公司卷制；中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO），購(gòu)自上海通派生物科技有限公司；鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)準(zhǔn)菌株TA97，TA98，TA100和TA102，由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫研究院提供；健康、清潔級(jí)SD雄性大鼠，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基（HyClone）；胎牛血清（Hyclone）。胰蛋白酶（TransGen）；二氨基芴、敵克松（Sigma）。二甲基亞砜、中性紅染料、多氯聯(lián)苯等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 儀器

多功能酶標(biāo)儀（Spectra Max M5，美國(guó)）；倒置顯微鏡（Olympus BX 51，日本）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Galaxy 170S，上海創(chuàng)奕）；超凈工作臺(tái)（VS-840-1，上海博迅）；水浴振蕩器（HZS-H，哈爾濱東聯(lián)）；微量振蕩器（MH-2，上海博迅）；高速冷凍離心機(jī)（KDC-140HR，安徽中科中佳）；高速勻漿機(jī)（S10，寧波新芝）。

1.4 方法

1.4.1 香煙煙霧提取物（CSE）的制備 其按照陸葉珍[12]、李威[13]的方法進(jìn)行。先將卷煙樣品置于溫度22℃、濕度60%的培養(yǎng)箱中水分平衡48 h；然后采用溶液吸收法制備CSE：將香煙與2支串聯(lián)的吸收管相接，管內(nèi)各裝5 mL DMSO和5 mL磷酸鹽緩沖液（PBS），抽吸裝置為50 mL注射器；一次燃燒1支煙，每次抽吸2 s，35 mL抽吸容積，抽吸間隔為58 s，采集過(guò)程中應(yīng)沒(méi)有煙霧泄露；重復(fù)采集10支煙制備成1.0支/mL的CSE溶液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 中性紅細(xì)胞毒性試驗(yàn) 中性紅細(xì)胞毒性試驗(yàn)參考SHIN等[14]的方法進(jìn)行。調(diào)節(jié)CHO細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200 μL，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入200 μL含不同濃度CSE的培養(yǎng)液（0×10-3，2.0×10-3，2.5×10-3，3.3×10-3，4.0×10-3，5.0×10-3支/mL），同時(shí)設(shè)置相應(yīng)的空白對(duì)照組，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，孵育（22±2）h后，倒置顯微鏡下觀察CHO的細(xì)胞形態(tài)。棄去培養(yǎng)液，每孔加入中性紅RPMI 1640無(wú)血清培養(yǎng)液（50 μg/mL）200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。培養(yǎng)結(jié)束后，去除中性紅溶液，每孔加入1%的甲醛溶液200 μL，固定1 min。去除固定液，每孔加入150 μL中性紅萃取液（V蒸餾水∶V乙醇∶V乙酸＝49∶50∶1，現(xiàn)配），置于微量振蕩器上振蕩10 min，采用酶標(biāo)儀測(cè)量540 nm處的吸光度值。

式中，X表示細(xì)胞存活率，ODn，ODc，ODo分別為樣品、細(xì)胞對(duì)照、空白的多孔平均吸光度值。

1.4.3 細(xì)菌誘變分析（Ames）試驗(yàn) 參考GB 15193.4—2003《鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)》[15]的方法進(jìn)行。

1.4.3.1 大鼠肝微粒體酶S9誘導(dǎo)及制備 多氯聯(lián)苯（PCB）溶于玉米油（質(zhì)量濃度為200 mg/mL），按500 mg/kg給大鼠腹腔注射，5 d后頸椎脫臼處死。無(wú)菌條件下取出肝臟，用冰冷的0.15 mol/L氯化鉀溶液沖洗干凈，稱質(zhì)量，每克肝加0.1 mol/L的氯化鉀溶液3 mL，用高速勻漿機(jī)制成肝勻漿，在4℃高速離心機(jī)上以9 000 r/min離心10 min，吸出上清液即為S9原液，臨用時(shí)按照1∶9的比例配制成10%的S9混合液。

1.4.3.2 平板摻入法檢測(cè) 在加（＋）S9或不加（－）S9活化系統(tǒng)下，用生物學(xué)鑒定合格的菌株（TA97，TA98，TA100和TA102）檢測(cè)CSE的致突變性。將提取的CSE原液分別稀釋0倍、2倍、4倍、8倍、16倍作為測(cè)試劑量組；二氨基芴、敵克松作陽(yáng)性對(duì)照物；用DMSO和PBS緩沖液1∶1混合液作陰性對(duì)照物；每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。分別取2 mL保溫的頂層培養(yǎng)基于無(wú)菌試管中，依次加入0.1 mL測(cè)試菌株，混勻；加入不同濃度的CSE 0.1 mL（需活化時(shí)加0.5 mL S9混合液），迅速混合后倒入底層培養(yǎng)基上，平鋪固化后于37℃培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計(jì)細(xì)菌突變菌落數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；各組間比較采用單因素方差分析（P＜0.05為差異顯著）。利用線性回歸計(jì)算EC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同煙草CSE對(duì)CHO細(xì)胞毒性的影響

各測(cè)試組的CHO形態(tài)學(xué)觀察顯示，對(duì)照組細(xì)胞以短梭形為主，邊界清晰可見(jiàn)，排列整齊，細(xì)胞大小均勻，相鄰細(xì)胞間連接較為緊密，貼壁良好，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛（圖1-A）；而CSE染毒組細(xì)胞出現(xiàn)死亡、數(shù)量較少，細(xì)胞群體呈無(wú)序的生長(zhǎng)狀態(tài)。GZY-4，GZY-6染毒組細(xì)胞形態(tài)多為長(zhǎng)梭形，有部分細(xì)胞變?yōu)閳A形，細(xì)胞排列分散，細(xì)胞膜不清晰（圖1-B，1-C）；GZY-9和NDY-1染毒組細(xì)胞形態(tài)大多數(shù)變?yōu)閳A形，細(xì)胞邊界模糊，胞體扁平且寬大，并且NDY-1組出現(xiàn)大量的細(xì)胞死亡（圖1-D，1-E）。

從圖2可以看出，4種煙草的CSE對(duì)CHO的細(xì)胞毒性具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，隨著CSE濃度的增加，各組的細(xì)胞存活率均逐漸降低；但與NDY-1相比，各測(cè)試組同濃度的CSE呈現(xiàn)出較高的細(xì)胞存活率，其大小依次為GZY-4＞GZY-6＞ GZY-9＞NDY-1。

比較4種煙草CSE的EC50值（半最大效應(yīng)濃度，即50%細(xì)胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)的測(cè)試樣品濃度）顯示（表1），NDY-1的細(xì)胞毒性顯著高于GZY-4和GZY-6（P＜0.05），GZY-9與NDY-1的EC50差異不顯著（P＞0.05），CSE對(duì)CHO溶酶體膜的損傷程度依次為NDY-1＞GZY-9＞GZY-6＞GZY-4，這與圖2的分析結(jié)果一致。

表1 不同煙草CSE對(duì)CHO細(xì)胞EC50值的影響

2.2 不同煙草CSE對(duì)S.typhimurium （his-）菌株致突變性的影響

Ames分析顯示，與－S9相比，＋S9有助于CSE樣品中某些物質(zhì)的活化，從而提高其致突變性。無(wú)論是－S9還是＋S9，NDY-1對(duì)TA97和TA98的致突變性最大；各組CSE的移碼突變能力表現(xiàn)為：與NDY-1相比，GZY-4，GZY-6對(duì)TA97，TA98菌株的回復(fù)突變數(shù)呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì)；雖然GZY-9也降低了對(duì)TA97的回復(fù)突變數(shù)，但對(duì)TA98的回復(fù)突變數(shù)基本一致；GZY-4，GZY-6和 GZY-9對(duì)TA100的堿基置換突變力較NDY-1顯著降低，降低程度依次為GZY6＞GZY-4＞GZY-9；3種CSE對(duì)TA102的致突變性也較NDY-1明顯降低。初步表明，CSE對(duì)鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的致突變性大小呈現(xiàn)出NDY-1＞GZY-9＞GZY-4＞GZY-6的趨勢(shì)（圖3）。

3 討論

中性紅是一種弱陽(yáng)離子染料，極易被正常細(xì)胞攝取并在溶酶體內(nèi)聚集。當(dāng)細(xì)胞受到毒物作用，導(dǎo)致細(xì)胞膜和溶酶體膜發(fā)生損傷時(shí)，細(xì)胞的中性紅攝入能力會(huì)下降，可以間接反映細(xì)胞的存活情況，因此，中性紅試驗(yàn)被廣泛地用于香煙煙霧的生物學(xué)活性檢測(cè)[16]。CHO細(xì)胞是加拿大衛(wèi)生部推薦用于評(píng)估香煙煙霧細(xì)胞毒性的細(xì)胞系，對(duì)香煙煙霧提取物（CSE）的敏感度適中，測(cè)試結(jié)果比較穩(wěn)定[17]。香煙煙霧中含有大量的自由基，能引起細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，生成對(duì)細(xì)胞具有毒性作用的過(guò)氧化物，直接影響膜結(jié)構(gòu)，以致膜通透性增大，使溶酶體等細(xì)胞器膜腫脹、溶解及破壞，導(dǎo)致細(xì)胞的廣泛性損傷。本研究結(jié)果顯示，高濃度的CSE能夠引起細(xì)胞存活率顯著降低，而且不同基因型煙草的細(xì)胞毒性存在一定的差異，這與BOMBICK等[18]的研究結(jié)果一致。4種煙草的細(xì)胞毒性大小依次為NDY-1＞GZY-9＞GZY-6＞GZY-4。GZY-4，GZY-6和GZY-9與NDY-1相比，半最大效應(yīng)濃度（EC50）分別增加了148.0%，45.9%和8.9%，表明GZY-4和GZY-6能顯著降低對(duì)CHO溶酶體膜的損傷（P＜0.05）；GZY-9也降低了其對(duì)CHO的細(xì)胞毒性，但與NDY-1相比，毒性差異不顯著（P＞0.05）。

Ames試驗(yàn)以組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌為標(biāo)準(zhǔn)菌株，TA97，TA98用于檢測(cè)能發(fā)生移碼突變的誘變劑，TA100用于檢測(cè)引起堿基對(duì)置換的誘變劑，TA102能檢測(cè)出其他測(cè)試菌株不能檢出或極少檢出的某些誘變劑。當(dāng)無(wú)組氨酸的培養(yǎng)基中有致突變物存在時(shí)，該菌株能回復(fù)突變?yōu)橐吧停跓o(wú)組氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；香煙煙霧中的NNK、焦油等致癌物，具有較強(qiáng)的致突變作用，故可以根據(jù)菌落的回復(fù)突變數(shù)來(lái)衡量香煙煙霧的基因毒性[9，19-20]。本研究結(jié)果顯示，CSE加S9后的致突變活性均明顯高于不加S9的致突變活性，這與PREFONTAINE等[21]的研究結(jié)果一致；GZY-4，GZY6和GZY-9較NDY-1對(duì)TA97的致突變性降低，而GZY-9對(duì)TA98的回復(fù)突變性無(wú)顯著影響；GZY-4，GZY-6和GZY-9也能顯著降低對(duì)TA100的致突變活性；在+S9的情況下，GZY-4，GZY6和GZY-9對(duì)TA102的致突變性較NDY-1降低，這可能與各基因型煙草的化學(xué)成分差異有關(guān)[9]。

綜上所述，對(duì)煙草品種進(jìn)行遺傳改良，能夠降低煙草制品的相對(duì)毒性。煙草燃燒后，固有化學(xué)成分的差異會(huì)造成釋放的香煙煙霧化學(xué)成分在組成和含量上發(fā)生變化，最終導(dǎo)致不同的毒理學(xué)效應(yīng)[22]，培育優(yōu)良品種可能是提高煙草安全性與可用性的有效措施之一。

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In vitro Analysis on Cytotoxicity and Mutagenicity of Different Genotypes Tobacco

ZHANGYongjian1，WEI Keqiang1，YANGJinwen2

（1.College ofLife Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.College ofAgronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

To analyze the toxic effects of different genotypes tobacco,including GZY-4,GZY-6,GZY-9 and NDY-1,the neutral red assay and Ames test were used to assess the cytotoxicity and mutagenicity oftheir cigarette smoke extract（CSE）.The results showed that the Chinese hamster ovary（CHO）viability of GZY-4,GZY-6 and NDY-9 was higher than that of NDY-1.Compared with NDY-1, the EC50of GZY-4 and GZY-6 was significantly increased（P＜0.05）.The sequence of the various cytotoxic ability was as follows: NDY-1＞GZY-9＞GZY-6＞GZY-4.S9activation could amplify the mutagenicity response to the Salmonella typhimurium（his-）strains,which were treated by CSE.Compared with NDY-1,the two CSE samples（GZY-4 and GZY-9）could decrease the ability of frameshift mutation and base substitution.Especially,the mutagenic properties of GZY-6 was significantly decreased（P＜0.05）.These results suggested that it was an important meaning to enhance the safety and availability oftobacco by the genetic improvement.

tobacco;CSE;cytotoxicity;mutagenicity

S572

A

1002-2481（2017）03-0374-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.03.14

2016-10-31

國(guó)家煙草專賣局重點(diǎn)科技項(xiàng)目（110199901005）；山西省回國(guó)留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目（2013-024）

張永健（1991-），男，山西孝義人，在讀碩士，研究方向：動(dòng)物分子細(xì)胞生物學(xué)。魏克強(qiáng)為通信作者。