埃氏小球藻對11種抗生素的敏感性

王亞君，周廣航，季春麗，薛金愛，李潤植

（山西農業大學分子農業與生物能源研究所，山西太谷030801）

埃氏小球藻對11種抗生素的敏感性

王亞君，周廣航，季春麗，薛金愛，李潤植

（山西農業大學分子農業與生物能源研究所，山西太谷030801）

為了探討埃氏小球藻（Chlorella emersonii）株系SXND-12對11種抗生素的敏感性，采用分光光度法研究了氯霉素、潮霉素、紅霉素、利福平霉素、卡那霉素、硫酸新霉素、頭孢霉素、大慶霉素、氨芐霉素、羧卞霉素、鏈霉素等11種抗生素對埃氏小球藻生長的影響，從而來確定分離、純化藻株時對藻細胞無害并能抑制伴生雜菌生長的抗生素濃度。結果表明，埃氏小球藻對頭孢霉素、氨芐霉素、羧卞霉素、硫酸新霉素敏感性較弱，對利福平霉素較為敏感，200 μg/mL（致死劑量）即0.243 mmol/mL（致死濃度）時，在固體培養中抑制了埃氏小球藻的生長；對潮霉素、氯霉素、紅霉素、鏈霉素、大慶霉素、卡那霉素非常敏感，在固體培養中的致死劑量分別達到20 μg/mL（0.101 mmol/mL），50 μg/mL（0.155 mmol/mL），30 μg/mL（0.041 mmol/mL），50 μg/mL（0.086 mmol/mL），50 μg/mL（0.105 mmol/mL），100 μg/mL（0.206 mmol/mL）。研究可為篩選出小球藻基因工程藻株的篩選試劑、誘變篩選的初篩試劑、建立無菌體系的選擇試劑奠定基礎。

埃氏小球藻；抗生素；敏感性；生長抑制

隨著經濟的不斷發展和人口的不斷增加，全球范圍內的能源枯竭現象越來越嚴重，傳統石化資源的開發和利用面臨著前所未有的嚴峻形勢：石油、天然氣在50 a內將消耗殆盡，煤炭在100 a后也將枯竭[1]，因此，發展新型的可再生生物能源——生物柴油已刻不容緩。生物柴油是一種可替代石化柴油的新型能源，而以動植物油脂、廢棄油脂來制備生物柴油[2]，原料成本占到70%以上，并且原料供給不穩定，產品質量無法保證。能源微藻是近年來發展起來的一種新型的產油材料，在缺氮的條件下油脂可大量積累，并且主要化學成分非常適合制備生物柴油，其被認為具有廣闊的發展前景[3]。

微藻是一種光合自養型生物，同等條件下光合速率高于其他植物數倍，不僅具有較短的生長周期，而且在適應性、生物量等方面具有巨大的優勢。小球藻可大規模培養[4]，油脂含量又高，使其具備了制備一種新型油料物質的潛力[5]。但是目前自然界存在的藻種都無法滿足大規模工業生產的需求。所以，當前獲得優異工業藻株是微藻規模化培養和聯產微藻燃油的一個關鍵制約因素。培育優異藻種通常有遺傳轉化和誘變2種主要方法。其中，遺傳轉化目標針對性強，誘變產生的突變株較多，短時間內就可能產生一個巨大的突變庫。但是如何高效地篩選目標變異藻株是這2種方法面臨的一個重要問題。在遺傳轉化體系中，外源基因成功導入受體細胞后，會使新的菌株帶有某種特殊的性質，即抗生素陽性選擇性標記，可為大規模的藻種鑒定提供強有力的幫助。而對于誘變產生的不定向突變體的初篩，工作量十分龐大。選取合適的抗生素[6]作為初篩試劑，可大大減少篩選工作量，提高篩選效率。

為篩選得到可用作埃氏小球藻基因工程和誘變產生突變體的選擇試劑，本試驗選取了常見的11種不同抗生素，研究埃氏小球藻對它們的敏感性，旨在為建立和完善埃氏小球藻突變體篩選體系提供參考和依據。

1 材料和方法

1.1 藻種

試驗所用的埃氏小球藻（Chlorella emersonii）株系SXND-12由山西農業大學分子農業與生物能源研究所從山西省境內分離、鑒定獲得，現保存于山西省科技重大專項微藻燃油基地實驗室。

表1 BG11培養基（母液）配方

本試驗主要以埃氏小球藻在含有不同種類和不同濃度的抗生素固體培養基上藻落長出的時間、一定時間內藻落存活的數量以及整個生長過程中的生長速度及狀態，作為抗生素影響埃氏小球藻生長的指標，并計算出各條件下的致死率，進而篩選出適合遺傳轉化和化學物理誘變初篩的抗生素試劑。

1.2 培養基

BG11液體和固體培養基按照表1，2的配方進行配制，121℃高壓滅菌20 min。滅菌前固體培養基中添加1.2%的瓊脂。按照實驗要求加入各種抗生素。

表2 BG11工作液配方

1.3 主要試劑

鏈霉素（Streptomycin）、氯霉素（Chlorampheni col）購自華美生物工程公司，卡那霉素（Kanamycin）、氨芐霉素（Ampicillin）、羧芐霉素（Carbenicillin）、潮霉素（Hvgromvcin）購自廣州博衍生物科技有限公司，頭孢霉素（Cefotaxime）、慶大霉素（Gentamycin）購自鄭州豫新制藥公司，利福平霉素（Rifampicin）、紅霉素（Erythromycin）、硫酸新霉素（Neomycin）購自Invitrogen公司。其中，潮霉素購買的是100 mg/mL母液，其他的均是粉末，母液的配制參照文獻[7]進行，并用0.22 μm/mL濾膜過濾除菌。

1.4 培養方法

1.4.1 接種物的制備 在平板上挑取體積較大、生長狀態良好的埃氏小球藻藻落，利用接種針將其接種于含有一定量新鮮培養液的三角燒瓶中，7 d后轉接到體積為250 mL的三角燒瓶進行擴大培養，長至指數期離心，轉速為6 000 r/min，時間5 min，倒掉上清液，無菌水洗滌2～3次，用一定量新鮮的滅菌培養液懸浮，用于接種。

1.4.2 液體培養 將懸浮液轉接到含有一定量培養液的100 mL三角燒瓶中，利用紗布將瓶口包裹若干層，防止細菌侵入。設置培養條件為光照強度5 000 lx，濕度控制在50%，溫度控制在（25± 0.5）℃，光暗比12 h∶12 h，pH值8.5。

1.4.3 固體培養 取一定量對數期的藻液，取100μL涂布于BG11固體平板上，設置培養條件為光照強度5 000 lx，濕度控制在50%，溫度控制在（25± 0.5）℃。

1.5 埃氏小球藻對11種抗生素敏感性測試

將埃氏小球藻進行固體培養并按抗生素的種類分為11組試驗，每組6～8個梯度，每個梯度做3個平行，其中，將抗生素濃度為0的試驗組作為對照，以消除試驗誤差。根據預試驗結果，各種抗生素的最終濃度設置列于表3。每天觀察各平板上藻落生長情況，30 d時統計長出的藻落數目，計算致死率。

式中，X0表示對照組平板上長出的藻落數，X1表示各種抗生素平板上長出的藻落數目。

表3 11種抗生素的最終質量濃度梯度 μg/mL

2 結果與分析

2.1 埃氏小球藻對氨芐霉素、羧芐霉素、硫酸新霉素和頭孢霉素敏感性固體試驗結果

在固體培養中，在設定的試驗濃度范圍內，Amp（氨芐霉素），Car（羧芐霉素），NM（硫酸新霉素），Cefo（頭孢霉素）等4種抗生素基本不影響小球藻的正常生長。光照培養箱內適宜條件下培養7 d左右，對照組和試驗組均能長出大量的藻落，10 d左右時，平板上的藻落數目趨于穩定。圖1～圖4是各試驗組在相同條件下培養10 d時的圖片。統計發現，圖1～圖4每個平板上的藻落數分別大約為3 500，1 500，1 800，2 200個，每個試驗組內各個濃度平板上的藻落數量基本一致，誤差在±5%左右。因此，從藻落長出的時間和數目這2個方面進行判斷可知，在試驗范圍內這4種抗生素對小球藻的生長沒有影響。

2.2 埃氏小球藻對氯霉素敏感性固體試驗結果

氯霉素通過阻礙蛋白質合成，抑制細胞生長，導致細胞死亡，對很多藻類的生長均有一定的抑制作用[8-12]。黃健等[8]研究表明，新月菱形藻（Nitzschia closterium Ehr.）、牟勒氏角刺藻（Chaetoceros muelleri Lemm.）、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum Bohl.）、綠光等鞭金藻8701（Isochrysis galbana Parke 8701）、亞心形扁藻（Platymonas subcordiformis（Wille）Hazen）、小球藻（Chlorella vulgaris Beij.）等6種海洋微藻對氯霉素普遍敏感。曹軍平等[10]對金藻的研究也得出了相似的結論。本試驗的結果也證實了這一點。由圖5可知，質量濃度在5～10 μg/mL范圍內，氯霉素對小球藻的生長起到了一定的延緩作用，因為與對照組相比藻落在固體培養基上長出的時間延遲了5 d。當氯霉素達到50μg/mL時，小球藻的致死率達到96.23%，與對照相比，在30 d的培養時間內僅長出了少許藻落，且生長速率極慢，藻落也較小。本研究表明，小球藻對氯霉素的致死質量濃度為50 μg/mL（0.155 mmol/mL），與其他研究結果[7]較為吻合。但是用氯霉素作為遺傳轉化的選擇性標記時需要注意，氯霉素的溶劑是乙醇，相關研究表明，乙醇對某些藻的生長具有一定的影響，所以，選擇氯霉素時要考慮乙醇對試驗的影響。

2.3 埃氏小球藻對紅霉素敏感性固體試驗結果

紅霉素主要通過抑制mRNA的移位阻礙轉肽作用，使核蛋白體上延伸的肽鏈解離，不再形成正常功能的蛋白質，從而抑制蛋白質的生物合成。劉濱揚等[11]關于紅霉素對微藻敏感性的研究證實，紅霉素對某些微藻在很低的濃度時就會有較強的抑制作用。小球藻對紅霉素非常敏感，在很低的濃度下就完全抑制了小球藻的生長，它的抑制能力甚至超過了報道中常提到的潮霉素和氯霉素[12]。從圖6可以看出，在5～20 μg/mL范圍內，隨著抗生素質量濃度的不斷增加，小球藻對其敏感性也呈增強趨勢，當紅霉素質量濃度高于20 μg/mL時，小球藻的致死率急劇增加，從20 μg/mL的51.75%驟增至30 μg/mL的100%。

紅霉素自發現以來廣泛的應用于臨床醫學，在小球藻性基因方面應用的比較少，但鑒于小球藻對其敏感性，紅霉素具有作為陽性篩選標記基因的潛在價值。

2.4 埃氏小球藻對利福平霉素敏感性固體試驗結果

利福平霉素是通過阻礙DNA正常轉錄過程而達到殺菌目的的一種抗生素，但在微藻基因工程方面關于利福平作為抗生素的報告非常少，本試驗的研究較好地填補了這個空缺。由圖7可知，質量濃度為5～100 μg/mL時，小球藻的生長只是在一定程度上受到影響；質量濃度為200 μg/mL時，致死率達到了94.1%，主要表現為經過30 d的固體培養平板上長出少數幾個藻落，且其生長速率極慢，可能是由抗生素破壞了小球藻的生理結構所致。另外，在研究中還發現，與其他抗生素相比，利福平霉素會使小球藻的生長產生嚴重的滯后現象，在整個試驗濃度范圍內這種現象都非常明顯。當利福平霉素的質量濃度為5 μg/mL時，致死率僅為23.66%，但是它與對照相比藻落長出的時間卻推遲了7 d左右；在0～100 μg/mL范圍內，30 d時統計發現，在數目上各試驗組基本沒有差別，但是藻落長出的時間卻隨著抗生素濃度的增加不斷地延遲，有的甚至20 d時才長出藻落；當質量濃度達到200 μg/mL時，統計發現，不僅最終存活藻落數大量減少，其生長的速度也明顯遲緩。

2.5 埃氏小球藻對潮霉素敏感性固體試驗結果

潮霉素是小球藻基因工程中常用的抗生素[13]，主要是通過磷酸轉移酶的磷酸化作用，改變分子結構，致使細菌死亡[14]。王長海等[14]研究表明，潮霉素對海水小球藻的抑制性較低，但是淡化培養時5 μg/mL的質量濃度幾天后就會造成小球藻死亡。另外，大量研究表明[15]，海帶、節旋藻、螺旋藻[16]、小球藻、裙帶、鹽藻等均對潮霉素有較高的敏感性。從圖8可以看出，質量濃度為5 μg/mL時，小球藻的致死率達到了61.59%，與相關研究的結果基本一致；質量濃度為7.5 μg/mL時小球藻死亡率高達94.92%，嚴重抑制了小球藻的生長；質量濃度為15 μg/mL時，小球藻全部死亡，主要表現在在規定的培養時間內（30 d）最終存活的藻落數為0。表明埃氏小球藻對潮霉素非常敏感。

2.6 埃氏小球藻對慶大霉素敏感性固體試驗結果

慶大霉素與氯霉素的抑菌原理相近，都是通過抑制蛋白質的合成起到殺菌的作用。臧曉南等[15]研究表明，Arthrospira341對慶大霉素比較敏感，在較低的濃度下，培養7 d左右就會發現有大量的藻絲死亡。王逸云[17]研究表明，海水小球藻對慶大霉素敏感性極低，幾乎不影響小球藻的生長。由圖9可知，當慶大霉素質量濃度為20 μg/mL時就已對小球藻的生長造成重大影響，經統計發現，在培養30 d后的固體培養基中，與對照相比藻落的數目減少約60%，個體較小、顏色呈淡黃色；當慶大霉素質量濃度達到30 μg/mL時，對小球藻的致死率達到91.04%；在50 μg/mL的固體培養基上，培養20 d僅僅有少許幾個藻落長出，并且這幾個藻落顏色呈土黃色，藻落如同針尖，生長非常緩慢。表明埃氏小球藻對慶大霉素比較敏感。

2.7 埃氏小球藻對卡那霉素敏感性固體試驗結果

目前，卡那霉素抗性基因在遺傳轉化體系中應用非常廣泛，是一種常見的選擇性標記基因[18-20]，主要是通過干擾蛋白質的合成抑制葉綠體的正常功能來殺死植物細胞。雒淑珍等[21]用卡那霉素作為選擇性標記獲得了具有良好性狀的野罌粟轉基因植株。臧曉南等[15]研究卡那霉素對Spiulina351生長影響時發現，50 μg/mL即可對其生長造成明顯的影響，主要表現為微藻生長緩慢，藻體顏色變黃下沉。王長海等[14]以海水小球藻為材料進行研究，發現在卡那霉素高達500 μg/mL時，長時間培養小球藻時其依然表現出良好的長勢。由圖10可知，淡水小球藻對卡那非常敏感，在50 μg/mL的固體平板上培養30 d長出的藻落數目約占對照數目的0.1%，這與相關報道有較大的差別，可能是由海水與淡水離子濃度種類的差異性所造成的，離子的不同造成了抗生素表達活性的差異。

2.8 埃氏小球藻對鏈霉素敏感性固體試驗結果

Str是鏈霉素的標記性基因，它在植物的遺傳轉化中應用比較廣泛，其主要作用原理是通過無功能蛋白質的合成或失去合成蛋白的功能，致使細胞膜破裂，內溶物流出，細胞大量死亡。黃健等[8]研究表明，在其選取的5種抗生素中，亞心形扁藻對鏈霉素最不敏感，隨抗生素濃度的提高其相對增長率變化不明顯。耿德貴等[9]關于微藻對抗生素敏感性的研究表明，鹽藻在較高的鏈霉素濃度下經過超過20 d的培養仍能健康地生長，并表現出良好的生長態勢。王長海等[14]研究表明，小球藻不但對鏈霉素不敏感，而且在一定的濃度范圍內還會起到一定的促進作用。從圖11可以看出，小球藻對鏈霉素比較敏感，鏈霉素對小球藻的生長影響較大，30 μg/mL時小球藻的致死率達到了93.45%，基本上抑制了小球藻的生長；在50 μg/mL的質量濃度下培養30 d，平板上長出的藻落數目不到對照組的0.02%，說明其嚴重抑制了埃氏小球藻的生長。這與其他相關報道的結果相差較大，可能是這株小球藻在培養過程中，由于某些特殊的原因其生理性狀發生了改變，或者是因為抗生素在一定的離子濃度下才起作用，本試驗培養基所用水屬于硬水，鈣離子含量很高，可能影響了抗生素的某些特性，使小球藻對鏈霉素敏感性增加。

2.9 7種抗生素致死劑量的確定

在微藻的正常培養中，小球藻細胞壁上極易吸附細菌，這些細菌與小球藻形成共生體系，不易除去[22]。雜菌的大量繁殖會造成大量營養物質的消耗，進而影響微藻的生長。本試驗通過測試微藻培養體系中埃氏小球藻藻體對抗生素的敏感性發現，氨芐、羧卞、頭孢、硫酸新霉素這4種抗生素在試驗濃度范圍內對埃氏小球藻的生長沒有影響，而細菌對抗生素卻比較敏感，因此，可以根據埃氏小球藻藻體和細菌對抗生素敏感性的差異，選取這些抗生素清除微藻培養過程中雜菌，以求建立埃氏小球藻無菌培養體系，并對該體系中埃氏小球藻生長環境條件進行優化。

雖然小球藻已經可以大規模地培養，但是要真正達到工業要求的標準還需要進一步進行藻種的改良。改良藻種常用的方法是基因工程和誘變，這2種方法都存在目標藻株篩選困難的情況，前人通過研究發現，抗生素在突變株的初篩和目標藻株的篩選方面具有良好的效果。本試驗研究了對埃氏小球藻比較敏感的7種抗生素（表4）以便在埃氏小球藻的育種篩選工作中更好地選擇所需要的抗生素，從而為后續的試驗提供參考。

表4 7種抗生素致死濃度分析

3 結論與討論

抗生素（antibiotics）是由微生物（包括細菌、真菌、放線菌屬）或高等動植物在生活過程中所產生的具有抗病原體或其他活性的一類次級代謝產物，能干擾其他生活細胞發育功能的化學物質。

在遺傳轉化體系中，外源基因成功導入受體細胞后，會使新的菌株帶有某種特殊的性質，即抗生素陽性選擇性標記，可為大規模的藻種鑒定提供強有力的幫助。建立一個完整的轉化體系，首先需要選擇一個合適的陽性篩選標記，它可以在后續的轉基因藻株的篩選工作中起到非常重要的作用，使篩選更加快速、高效。本試驗的研究發現，埃氏小球藻對氯霉素、紅霉素、卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素、潮霉素等6種抗生素非常的敏感，并且這6種抗生素的標記基因已經被廣泛研究和應用；潮霉素、氯霉素、卡那霉素在高等植物和藻類的遺傳轉化體系中已廣泛使用，并取得了一些良好的效果；鏈霉素、紅霉素在基因工程中應用較少，特別是紅霉素相關的報道幾乎沒有，本試驗研究結果可為遺傳轉化的陽性篩選標記提供技術參考。

誘變是改良藻種的另一種常用的方法，因為其在短時間內就可能產生一個巨大的突變庫，但是誘變產生的不定向突變體的初篩，工作量十分龐大。選取合適的抗生素作為初篩試劑，可大大減少篩選工作量，提高篩選效率。抗生素抗性篩選是基于微生物對抗生素產生耐藥性發展起來的菌株選育改良技術，實踐證明，操作簡單，效果明顯，在微生物藥物領域得到廣泛應用[23]。微生物的某些抗生素抗性突變會直接影響其次生產物的代謝調控系統[24]，從而改變突變株代謝產物的生產水平和能力，因此，抗性篩選可用于有用產物生產優良菌株的選育和改良，在微生物藥物領域抗生素抗性篩選技術原本主要用來篩選獲取高產菌株[25]，但近來發現，微生物的抗生素抗性突變還可賦予突變株新生次級產物的代謝生產能力。由于微藻和微生物具有相似的繁殖方式及代謝機制，所以，可以利用誘變和抗生素篩選相結合的方法，對微藻突變株進行篩選。關于抗生素抗性篩選提高產能的生物學機制的研究在鏈霉素和利福平霉素抗性突變株的篩選中具有良好的效果[26]。

抗生素通過不同的作用機理可以抑制或殺死細菌、真菌等不同的病原微生物，因此，可作為一種建立微藻無菌體系的試劑。倘若某種抗生素對微藻的生長沒有影響，同時又具有良好的除菌效果，那么它將成為建立無菌體系的最佳途徑。本研究發現，氨芐霉素、羧卞霉素、頭孢霉素、硫酸新霉素等4種抗生素在試驗濃度范圍內不影響小球藻的生長。因此，可將其用于建立埃氏小球藻的無菌體系，考慮到病原菌的耐藥性及更佳的除菌效果，可將幾種抗生素混合使用，以達到最佳的使用效果。

研究抗生素對微藻生長的影響，在微藻的藻種改良及培養工作中都具有非常重要的作用，可為獲得適合微藻規模化培養并聯產微藻燃油的工業藻株提供參考。

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Study on the Sensitivity of Chlorella emersonii to Eleven Kinds of Antibiotics

WANGYajun，ZHOUGuanghang，JI Chunli，XUE Jin'ai，LI Runzhi

（Institute ofMolecular Agriculture and Bioenergy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

To investigate the sensitivity of strain SXND-12（Chlorella emersonii）to 11 antibiotics,the study was conducted by spectrophotometry to evaluate the effects of 11 antibiotics（chloramphenicol,hygromycin,erythromycin,rifampicin,kanamycin,neomycin sulfate,cephalosporins,daqingmycin,ampicillin,carboxomycin and streptomycin etc.）on growth of Chlorella emersonii to determine concentration of antibiotics in isolation and purification of algae,which was harmless to algal cells and could inhibit the growth of associated bacteria.The results showed that Chlorella emersonii was less sensitive to cephalosporin,ampicillin,carboxymycin and neomycin sulfate,was more sensitive to rifampicin（concentration of 200 μg/mL（lethal dose）as well as 0.243 mmol/mL（lethal concentration）in the solid culture which could inhibit the growth of Chlorella emersonii,and was very sensitive to hygromycin, chloramphenicol,erythromycin,streptomycin,daqingmycin,kanamycin（lethal concentration in the solid culture reached 20 μg/mL（0.101 mmol/mL）,50 μg/mL（0.155 mmol/mL）,30 μg/mL（0.041 mmol/mL）,50 μg/mL（0.086 mmol/mL）,50 μg/mL（0.105 mmol/mL）, 100 μg/mL（0.206 mmol/mL,respectively）.This study laid a foundation for screening reagents for chlorella genetic engineering, mutagenesis screening early screening reagents,and establish a selection reagent for sterile systems.

Chlorella emersonii;antibiotics;sensitivity;growth inhibition

S949.93

A

1002-2481（2017）03-0379-07

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.03.15

2016-12-06

國家“948”項目（2014-Z39）；山西省煤基重點科技攻關項目（FT-2014-01）

王亞君（1990-），女，山西忻州人，在讀碩士，研究方向：生物固碳與生物質綜合利用。李潤植為通信作者。