圍產期高脂高糖孕鼠NP暴露對仔鼠肥胖的影響及機制探討

李文梅，俞捷，羅婭，王攀，楊雪松，楊靜，許潔

(1遵義醫學院公共衛生學院，貴州遵義563099；2遵義醫學院附屬醫院)

肥胖已成為全球性公共衛生問題，可促進多種慢性疾病發生發展，是導致心腦血管疾病、2型糖尿病發病的重要原因之一[1]。諸多研究認為不良生活方式是導致肥胖的主要原因，近年來研究發現，暴露于環境內分泌干擾物(EDCs)中也可導致脂肪形成和肥胖發生，特別是在胎兒及嬰幼兒等發育關鍵時期，機體對激素活性的化學物質較敏感，易受其毒害作用；另外胎兒和新生兒代謝率高于成年人，使得新生兒和兒童對EDCs接觸越早、影響越大[2～4]。壬基酚(NP)是EDCs的代表物，與雌二醇結構相似，具有雌激素效應和生物毒性作用，對生物體產生的不良作用包括對內分泌系統、生殖系統和免疫系統的影響及促癌作用等[5]。目前，NP在工業中用作洗滌劑、乳化劑和潤濕劑的重要原料，并且在油漆、殺蟲劑和家用化妝品中發現[6]。隨著環境污染的加重，在人脂肪、乳汁、尿液[7]中均可檢測出NP，母體暴露可通過胎盤和母乳使胎兒或新生兒接觸NP影響生長發育[8,9]。研究表明，NP與肥胖發生及脂肪形成有相關性，但其主要機制尚未闡明。飽和脂肪攝取過量是當代孕婦最普遍的不良飲食習慣[10]。母體的環境暴露導致體內的毒物高負荷，以及高脂高糖飲食后血脂等升高，可通過胎盤、乳汁等途徑傳遞給子代，影響子代脂代謝。2013～2015年，我們對圍產期高糖高脂孕鼠進行NP暴露，觀察子代血脂水平、體質量、脂肪質量和脂肪系數、脂肪生成和脂肪細胞分化基因、肝臟和脂肪病理變化，探討在母鼠圍產期高脂高糖飲食基礎上NP暴露對仔鼠肥胖發生的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、材料及儀器 清潔級健康未受孕的SD大鼠雌性40只、雄性20只，體質量170～240 g，購于第三軍醫大學動物中心；99%NP購自東京化成株式會社；飲水為Spring系列實驗室純水系統所制純水；普通飼料和高脂高糖飼料(配方為15%豬油，20%白糖，65%基礎飼料)于上海斯萊克實驗動物有限責任公司購買；全自動生化分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)；C-5050光學顯微鏡(日本Olympus公司)；電子分析天平(上海精科天平儀器廠)；DK-98-Ⅱ數顯水浴恒溫水浴鍋(天津泰斯特公司)；TDL-S離心機(上海安亭公司)；酶標儀(美國Bio Rad公司)。

1.2 分組方法 適應性飼養1周后，以雌雄大鼠2∶1的比例合籠進行交配，次日早晨檢查雌鼠，以陰栓或陰道涂片檢查到大量精子且處于動情期的雌鼠定為妊娠0 d，收集交配成功的孕鼠。隨機分為4組，即普通飼料對照組(OC組)、高脂高糖飼料對照組(HC組)、高脂高糖飼料+NP低劑量組(HNL組)、高脂高糖飼料+NP高劑量組(HNH組)，每組10只孕鼠。OC組食用普通飼料，其余三組均食用高脂高糖飼料，以75 g/(kg·d)進食干飼料進行分籠投食。

1.3 NP干預方法 從母鼠受孕第6天到產后第21天，OC組、HC組孕鼠均予玉米油0.5 mL/(kg·d)灌胃，HNL組、HNH組分別予NP 50、100 mg/(kg·d)灌胃，灌胃直至產后21 d斷乳時。仔鼠出生后正常進行母乳喂養，斷乳后均以普通飼料喂養至70 d。

1.4 仔鼠血脂水平測定 干預70 d結束后，空腹12 h后用10%水合氯醛麻醉，取仔鼠腹主動脈血，離心取血清，采用全自動生化分析儀檢測血清TG、TC、HDL及LDL水平。

1.5 仔鼠體質量、脂肪質量及脂肪系數測定 取血前稱仔鼠體質量。取血后取仔鼠性腺旁脂肪墊，用生理鹽水洗凈血液、濾紙吸干水分，電子天平稱仔鼠脂肪質量，計算脂肪系數=脂肪質量(g)/體質量(g)×100%。

1.6 仔鼠肝臟組織中脂肪細胞分化基因檢測 仔鼠剖殺后取肝臟組織，采用Real time PCR法檢測調控脂肪細胞分化的關鍵基因轉錄調節因子(CEBP-α)、固醇調節結合蛋白(SREBP-1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ (PPARγ)mRNA的表達。

1.7 仔鼠肝臟細胞、脂肪細胞形態觀察 取仔鼠肝臟組織和性腺旁脂肪組織，固定于4%的多聚甲醛溶液，石蠟切片后行HE染色，光鏡下觀察仔鼠肝臟細胞和脂肪細胞形態。

2 結果

2.1 各組仔鼠血脂水平比較 HC組、HNL組、HNH組血清TG、TC、LDL均高于OC組(P均<0.01)。HNL組、HNH組血清TG、TC、LDL均高于HC組(P均<0.01)。HNH組血清TG、TC、LDL均高于HNL組(P均<0.01)。見表1。

表1 各組仔鼠血脂水平比較

注：與OC組比較，*P<0.01；與HC組比較，﹟P<0.01；與HNL組比較，△P<0.01。

2.2 各組仔鼠體質量、脂肪質量及脂肪系數比較 HC組、HNL組、HNH組體質量、脂肪質量、脂肪系數均高于OC組(P均<0.01)。HNL組、HNH組體質量、脂肪系數均高于HC組，HNH組脂肪質量高于HC組(P均<0.01)。HNH組體質量、脂肪質量、脂肪系數均高于HNL組(P均<0.01)。見表2。

2.3 各組仔鼠肝臟組織中CEBP-α、SREBP-1、PPARγ mRNA表達比較 HNH組CEBP-α mRNA表達高于OC組(P<0.01)。HC組、HNH組SRE-BP-1 mRNA表達均高于OC組，HNH組的SREBP-1mRNA表達均高于HC組，HNH組的SREBP-1 mRNA表達高于HNL組(P均<0.01)。HC組、HNL組、HNH組PPARγ mRNA表達均高于OC組，HNH組PPARγ mRNA表達高于HC組，HNH組PPARγ mRNA表達高于HNL組(P均<0.01)。見表3。

表2 各組仔鼠體質量、脂肪質量及脂肪系數比較

注：與OC組比較，*P<0.01；與HC組比較，﹟P<0.01；與HNL組比較，△P<0.01。

表3 各組仔鼠肝臟組織中CEBP-α、SREBP-1、PPARγ mRNA表達比較

注：與OC組比較，*P<0.01；與HC組比較，﹟P<0.01；與HNL組比較，△P<0.01。

2.4 各組仔鼠肝臟細胞變化 OC組肝臟細胞未見脂肪變性和脂滴，HC組可見部分肝臟細胞脂肪變性，HNL組可見大量肝細胞脂肪樣變，HNL組可見肝細胞廣泛氣球樣變和大量脂滴。見圖1。

2.5 各組仔鼠脂肪細胞變化 OC組細胞大小均勻，未見明顯增大。HC組部分脂肪細胞面積增大，HNL組大部分脂肪細胞面積明顯增大，HNH組脂肪細胞增大的數目不僅增多，而且細胞面積最大。見圖2。

3 討論

肥胖發病率持續增加已成為全球公共衛生的挑戰。母體妊娠期不良飲食習慣易通過胎盤和母乳等方式影響子代脂代謝。目前NP作為增塑劑廣泛各種塑料制品中，是洗滌劑、乳化劑和潤濕劑的重要原料，存在于油漆、殺蟲劑、生活用品和化妝品中，致使長江[11]、大連河口[12]、海河、渤海灣和珠江三角洲河口水樣和沉積物中均能檢測到NP[13]，與世界其他河口地區相比較，已達到中等污染水平[14]，在地表水、雪和大氣沉積中可檢測出NP[15]。因此，對母體妊娠期EDCs暴露聯合不良飲食習慣是否會增加子代肥胖風險進行研究，對于預防新生兒肥胖具有重要意義。

研究發現，圍產期NP暴露可增加子代體質量、脂肪量、血清總膽固醇和葡萄糖水平[16]。NP可通過胎盤屏障或母乳喂養進入胎兒或新生兒體內，模擬雌激素作用對機體代謝穩態進行破壞，導致脂代謝平衡紊亂。低濃度的NP即可誘導脂肪細胞分化，影響甘油-3-磷酸脫氫酶活性和PPARγ的表達以及其脂肪形成所需的靶基因[16]，誘導脂肪組織中的永久性改變[17]，從而影響后代脂肪生成，使瘦素水平顯著升高，脂肪細胞數量和大小增加，干擾脂肪形成的關鍵調節劑和脂肪組織的脂肪生成途徑的基因表達，導致子代肥胖的發生[18]。本研究發現，HC組、HNL組、HNH組仔鼠血清TG、TC、LDL水平及體質量、脂肪質量、脂肪系數均高于OC組，HNL組、HNH組血清TG、TC、LDL體質量、脂肪系數均高于HC組，提示圍產期高脂高糖飲食及NP均可使仔鼠血脂水平、體質量、脂肪系數增高，且圍產期暴露NP后可進一步增高仔鼠的血脂水平、體質量、脂肪系數，進而促進子代肥胖的發生；HNH組脂肪質量高于HC組，提示圍產期NP暴露可使仔鼠脂肪組織成分增加。

注：A為OC組；B為HC組；C為HNL組；D為HNH組。

圖1 各組肝臟細胞形態表現(HE染色，×200)

注：A為OC組；B為HC組；C為HNL組；D為HNH組。

圖2 各組脂肪細胞形態表現(HE染色法，×100)

CEBP-α、SREBP-1、PPARγ作為糖脂質代謝的三個關鍵基因，參與脂代謝調節過程。CEBP-α基因是第一個被證明在脂肪細胞分化過程中起重要作用的轉錄因子，脂肪細胞的分化過程中必須要有CEBP-α，干擾CEBP-α基因后可使脂肪組織發育停滯。SREBP-1是一種在新生脂肪生成和糖酵解途徑中調節的關鍵轉錄基因，在肥胖患者中SREBP-1的水平顯著升高。PPARγ作為脂肪細胞主要轉錄因子可控制脂質儲存和動員，激活調節脂質體內平衡，在非脂肪組織中增加游離脂肪酸循環水平和脂質積累。本研究發現，HNH組的CEBP-α基因表達高于OC組，提示高脂飲食及NP可致CEBP-α基因的表達增加；HC組、HNH組的SREBP-1表達均高于OC組,HNH組的SREBP-1表達均高于HC組,HNH組的SREBP-1表達高于HNL組，提示高脂和NP可致大鼠肥胖相關SREBP-1的表達量增加；HC組、HNL組、HNH組的PPARγ均高于OC組，HNH組PPARγ表達高于HC組，HNH組的PPARγ表達高于HNL組，提示高脂飼料和NP可致PPARγ的表達量增加，而且隨著NP的染毒劑量增加其PPARγ的表達量增加。鏡下觀察肝臟和脂肪組織的病理性改變作為診斷機體脂肪量是否增加具有重要意義，本研究對仔鼠肝臟細胞鏡下觀察時發現，HNH組仔鼠出現肝細胞廣泛脂肪樣變范圍明顯多于HNL組肝細胞；對性腺脂肪細胞觀察發現，HNH組的脂肪細胞相對HNL組脂肪細胞面積進一步增大，而且數目增多。

綜上所述，圍產期高脂高糖孕鼠NP暴露可增加仔鼠的體質量和脂肪質量，促進血脂代謝紊亂，其機制可能與NP導致脂肪細胞分化基因CEBP-α、SREBP-1、PPARγ表達異常有關。因此建議圍產期婦女應盡量少接觸含有NP的物品，如油漆家裝、殺蟲劑、塑料制品、化妝品等，以避免NP對胎兒生長發育的影響。