慢性氟中毒大鼠腎組織Beclin1、LC3、p62、Bcl-2表達變化及意義

陳榮，于燕妮，徐淋，鄧超男

(貴州醫科大學，貴陽550004)

氟是一種化學性質極為活潑的鹵族元素，也是機體內所必需的微量元素之一。適量的氟對細胞代謝有著重要作用，但過量的氟則導致機體損傷。慢性氟中毒分為骨相和非骨相損傷，骨相損傷主要累及骨、軟骨及牙齒[1]，非骨相損傷主要累及肝、腎、神經、內分泌、生殖系統等，而腎是非骨系受損最嚴重的器官之一。由于腎臟組織中腎小管主要功能為重吸收，機體內絕大多數物質在此重吸收。因此，長期過量的氟攝入機體可使腎小管負荷過重，導致腎臟損傷。氟中毒致腎臟損傷的病理機制十分復雜，研究發現，凋亡是參與慢性氟中毒腎損傷的機制之一[2]。凋亡、自噬都屬于細胞程序性死亡，其中凋亡是機體細胞程序性死亡Ⅰ，自噬是機體細胞程序性死亡Ⅱ。在饑餓、氧化等應激狀態下，機體可通過自噬功能清除受損細胞和代謝廢物，參與細胞增殖、生長、凋亡、維持細胞內環境穩態和細胞正常的生理功能[3]。但凋亡與自噬是否共同參與慢性氟中毒腎損傷的機制尚不明確。2015年3月～2016年8月，我們檢測了慢性氟中毒大鼠腎組織中自噬相關因子微管相關蛋白1(Beclin1)、微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)、p62及抗凋亡因子B細胞淋巴瘤基因/白血病基因-2(Bcl-2)的表達變化，探討自噬與凋亡在慢性氟中毒腎損傷中的機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 4～5周齡SD大鼠36只，由貴州醫科大學動物中心提供。兔抗鼠多克隆抗體Beclin1、Bcl-2、p62(美國Abcam公司)；兔抗鼠多克隆抗體LC3(美國Cell Signaling公司)；PV-6001兔二步法免疫組化試劑盒、過氧化氫(H2O2)、蘇木素、檸檬酸鹽(北京中山金橋生物技術有限公司)；二氨基聯苯胺(DAB)、磷酸鹽緩沖液(北京中山金橋生物技術有限公司)；NaF分析純(天津市致遠化學試劑有限公司)；RT-PCR試劑盒(美國Thermo公司)；總RNA提取試劑TRIzol(美國Invitrogen公司)。

1.2 分組及模型制備 采取隨機數字法將36只大鼠隨機分為對照組、低氟組、高氟組，每組各12只(雌雄各半)。對照組飲用含氟化鈉低于1 mg/L自來水，低、高氟組飲用含氟化鈉分別為5、50 mg/L的自來水。干預6個月后，收集24 h尿液測尿氟，股動脈放血處死，取股骨測骨氟。以低氟組及高氟組大鼠出現氟斑牙，尿氟、骨氟明顯增高，肌酐、尿素氮明顯增高，證實氟中毒引起腎損害，表明氟中毒腎損害大鼠造模成功。

1.3 各組腎組織病理觀察 造模后股動脈放血處死大鼠，取一側腎臟于4%甲醛中固定、脫水，常規石蠟包埋，切片3 μm做HE染色，光鏡下觀察腎組織的病理形態學改變。

1.4 各組腎組織Beclin1、LC3、p62及Bcl-2蛋白表達檢測 采用免疫組織化學SP兩步法。取腎組織石蠟切片，脫蠟至水，高壓修復5 min，3%H2O237 ℃孵育10 min，山羊血清封閉20 min，分別滴加1∶200的Beclin1、LC3、Bcl-2一抗，1∶100的p62一抗；4 ℃過夜。次日復溫0.5 h，加二抗孵育20 min，DAB顯色，流水終止反應；蘇木素復染、脫水、透明、封片。用PBS代替一抗其他條件相同作為對照。用BIOMIAS-2001分析軟件進行圖像分析。

1.5 各組腎組織Beclin1、LC3、p62、Bcl-2 mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。取腎組織放于-80 ℃冰箱，于研缽中加入液氮研磨，加入TRIzol試劑，提取腎組織RNA，以β-actin作內參。Beclin1上游引物5′-AGTGGCGGCTCCTATTC-3′，下游引物5′-GGACACCCAAGCAAGAC-3′；LC3上游引物5′-TTCGCCGACCGCTGTAA-3′，下游引物5′-ATCCGTCTTCATCCTTCTCCT-3′；p62上游引物5′-TGAACCCTCTCGTGGTCGTG-3′，下游引物5′-AAAGCCCCTCTAGGTGGCC-3′；Bcl-2上游引物5′-CACGGTGGTGGAGGAAC-3′，下游引物5′-ACAGCCAGGAGAAATCAAA-3′；β-actin上游引物5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，下游引物5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′。PCR反應體系為20 μL，反應條件：94 ℃ 5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環。PCR產物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統進行掃描分析。

2 結果

2.1 各組大鼠腎組織病理表現 對照組大鼠腎臟腎小球及腎小管結構無明顯變化，腎小管上皮細胞排列整齊。低氟組、高氟組大鼠腎小管上皮細胞有不同程度的水腫，管腔狹窄。高氟組腎小管間質充血更明顯。

2.2 各組大鼠腎組織Beclin1、LC3、p62及Bcl-2蛋白表達比較 低氟組、高氟組Beclin1、LC3、p62、Bcl-2陽性表達顆粒位于細胞質內呈棕黃色，與對照組比較，低氟組、高氟組大鼠腎組織中Beclin1、LC3陽性表達數量多，顏色深，且隨染氟濃度的升高顏色加深，而p62、Bcl-2陽性表達數量低、顏色淺。詳見表1、圖1。

表1 各組腎組織Beclin1、LC3、p62、Bcl-2蛋白表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與低氟組比較，#P<0.05。

注：A為對照組；B為低氟組；C為高氟組。1 為Beclin1；2為 LC3；3為p62；4為Bcl-2。

圖1 各組大鼠腎組織Beclin1、LC3、p62、Bcl-2蛋白表達情況(免疫組織化學法，×400)

2.3 各組腎組織Beclin1、LC3、p62及Bcl-2 mRNA表達比較 與對照組比較，低氟組、高氟組腎組織中Beclin1、LC3 mRNA的表達均升高，p62、Bcl-2 mRNA表達均下降(P均<0.05)。高氟組Beclin1、LC3 mRNA表達均高于低氟組，p62、Bcl-2 mRNA表達均低于低氟組(P均<0.05)。詳見表2、圖2。

表2 各組腎組織Beclin1、LC3、p62及Bcl-2 mRNA表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與低氟組比較，﹟P<0.05。

注： M為Marker；1為對照組；2：低氟組；3為高氟組。

圖2 各組大鼠腎組織Beclin1、LC3、p62及Bcl-2 mRNA表達情況(RT-PCR法)

3 討論

地方性氟中毒也稱地氟病。地氟病是影響最為廣泛的一種全球性的化學性疾病，是由于居住環境出現大劑量氟，通過燃煤、飲水、食物等途徑進入機體，引起的一種慢性全身性疾病。受地氟病威脅的面積廣、人口多，全國除上海、海南兩省無氟中毒流行外，其余省市均有不同程度的流行，主要分布在貴州、四川、山東、遼寧等多個省，主要類型包括飲水型、飲茶型及燃煤污染性三大類。地氟病主要分為骨相損害和非骨相損害兩大類，骨相損害是指因氟對骨有較高的親和性，大劑量氟沉積在骨組織中，導致骨氟含量升高，氟對骨組織代謝紊亂的同時也破壞關節軟骨，引起關節退行性改變、關節硬化、軟化及骨質增生等病變[4]。非骨相損害方面，腎是受累最嚴重的非骨相器官之一，因腎是機體主要的排泄器官，約85%的體內氟從腎臟排出，但當過量的氟攝入機體超過腎臟代謝程度時，可致腎小管上皮細胞發生不同程度的水腫、變性，管腔狹窄，腎小球萎縮，影響腎小球的濾過及重吸收功能。

大量的研究表明，凋亡是參與慢性氟中毒腎損傷的機制之一[5,6]。凋亡是由基因調控的一種程序性死亡，在大劑量氟作用下，機體內氧自由基及過氧化物增多，細胞內大劑量的氟使細胞內氧自由基升高，使內質網、線粒體等細胞器處于氧化應激狀態，線粒體結構被破壞后釋放細胞色素C，激活下游Caspase啟動凋亡途徑，引起細胞凋亡[7]。也有研究采用電鏡下觀察慢性氟中毒腎組織時，發現腎小管上皮細胞有巨大線粒體形成，內質網擴張，胞核內異染色質有向核膜下聚集，細胞向凋亡方向發展[8]。Bcl-2是與細胞凋亡最密切的重要抗凋亡基因，其表達可阻斷凋亡的發生；Bcl-2能抑制細胞色素C的釋放從而抑制Caspase，發揮抗凋亡作用。Bcl-2還與自噬關系緊密，在自噬和凋亡中均有重要作用[9]。

自噬是機體細胞的一種程序性死亡方式，也稱為Ⅱ型程序性死亡，參與細胞增殖、生長、凋亡、維持細胞內環境穩態。LC3、p62均為與自噬相關的標志蛋白。LC3為微管相關蛋白1和輕鏈3，在自噬過程中LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺(PE)以泛素樣反應方式結合，向脂質形式LC3-Ⅱ轉化，以LC3-Ⅱ的形式穩定存在于自噬內外膜上，其含量與自噬泡數量成正比[10]，用于檢測自噬活性。p62又稱SQSTM1，是一種多功能的泛素化蛋白，主要在自噬體吞噬蛋白質時發揮重要作用[11]，定位于自噬小體內與LC3-Ⅱ結合形成復合物。研究發現，自噬被激活后，p62蛋白可在細胞質中不斷被降解，因此p62是反映自噬活性的標志性蛋白[12]。Beclin1是自噬形成的必須分子，介導自噬相關蛋白定位于自噬泡[13]，主要與Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K-Ⅲ)形成復合物，調節自噬相關基因蛋白并參與自噬的過程[14]。研究發現，自噬體雙層膜結構的形成是Atg14與Beclin1相互作用的結果，是自噬形成的關鍵起始階段[15]。因此，根據自噬相關因子LC3、Beclin1、p62表達情況能精準地反映自噬水平，而Bcl-2可反映凋亡情況。不僅如此，氟介導自噬和細胞凋亡之間存在某種聯系，自噬和凋亡關系錯綜復雜[16]。Beclin1作為自噬的誘導物，被認為是自噬和凋亡的重要橋梁[17]。研究發現，Beclin1上有BH3-only蛋白，而抗凋亡蛋白Bcl-2家族均有BH3的結合域，故Bcl-2與PI3K-Ⅲ可競爭性結合到Beclin1上，影響PI3K-Ⅲ與Beclin1的結合，從而抑制自噬的發生。研究發現，大鼠腎臟內有自噬體形成，而且這種自噬能被Bcl-2所抑制[18]，表明Beclin1及LC3的表達與腎疾病病變程度有關，自噬在腎組織損傷有重要作用[19,20]。自噬保護機體的各種免疫應答，促進細胞生存，是維持機體穩態一種重要的機制，但過度的表達或不當的自噬會加速細胞凋亡。本研究發現，慢性氟中毒大鼠的腎小管上皮細胞內Beclin1、LC3蛋白及mRNA表達較對照組明顯升高，p62和Bcl-2蛋白及mRNA則出現低表達，且高氟組Beclin1、LC3蛋白及mRNA表達均高于低氟組，p62、Bcl-2蛋白及mRNA表達均低于低氟組，提示慢性氟中毒時大鼠腎臟中自噬、凋亡同時激活，且其激活程度與氟中毒的程度有關，氟中毒較重時自噬、凋亡激活更加明顯。

綜上所述，慢性氟中毒后可使大鼠腎組織中自噬和凋亡同時激活，提示自噬和凋亡可能共同參與慢性氟中毒腎損害的發病機制。