檸檬自交后代抗柑橘潰瘍病的離體鑒定

譚李梅，劉 慧，朱志媚，周 東，湯 甜，鄧子牛

（1.湖南農業大學園藝園林學院，湖南 長沙 410128；2.國家柑橘改良中心長沙分中心，湖南 長沙 410128）

檸檬自交后代抗柑橘潰瘍病的離體鑒定

譚李梅1,2，劉 慧1，朱志媚1,2，周 東1，湯 甜1，鄧子牛1,2

（1.湖南農業大學園藝園林學院，湖南 長沙 410128；2.國家柑橘改良中心長沙分中心，湖南 長沙 410128）

為鑒定檸檬自交后代對柑橘潰瘍病的抗性，以檸檬鮮葉為材料，通過注射法和針刺法接種不同濃度潰瘍病菌菌液，對 114 株檸檬自交后代群體進行離體鑒定，并以感病材料冰糖橙、抗病材料枸櫞 C-05 作為對照。結果表明：檸檬自交后代對潰瘍病抗性存在個體間差異；其中，注射接種法中表現為抗 104和 105CFU/mL 病原菌的植株有 24 株，針刺接種法中表現為抗 108CFU/mL 病原菌的植株有 11 株；其中，有 6 株檸檬自交后代在2種鑒定方法中均被認定為抗病株。綜合2種鑒定方法，114 株檸檬自交后代中有 29 株對潰瘍病表現出抗 104CFU/mL 病原菌。

潰瘍病；檸檬自交后代；離體接種；抗性評價

柑橘潰瘍病是由柑橘黃單孢桿菌柑橘亞種（Xanthomonas citri subsp. citri） 引 起 的 一 種 細 菌 性 病害，對柑橘產業危害嚴重，世界許多國家將其列為重要檢疫性病害[1-2]。多數柑橘枝葉及果實感病后都會出現典型的火山口狀病斑，嚴重影響其樹勢和產量[3-4]。感病果實的外觀也會影響銷售，對產業發展產生不良影響。目前，主要還是采用化學藥劑來防治柑橘潰瘍病，根治起來較為困難。因此，選育抗病品種便成為解決這一問題的最有效途徑。由于對柑橘潰瘍病的抗性機理還不清晰，抗病品種的選育進展緩慢，目前還未育成有經濟價值的抗病品種。

檸檬是重要的高酸類柑橘栽培種，其主要品種有尤力克、里斯本、費米耐勞、菲諾等，均是柑橘潰瘍病的高感品種[5]。分子標記研究結果表明，檸檬 [Citrus limon（L.）Burm. f.]是枸櫞和酸橙類的雜交種[6-7]；由于其親本之一的枸櫞已被鑒定為是柑橘潰瘍病的抗病種類[8]，含有對潰瘍病的抗性基因 ；所以檸檬對潰瘍病的感病性狀應該來自于酸橙。由此推測，檸檬中控制柑橘潰瘍病抗性的基因應該為雜合狀態，其自交后代有可能出現抗性分離。因此，研究擬利用感潰瘍病檸檬品種尤力克為材料，構建自交群體，對其后代進行潰瘍病的離體抗性鑒定，以期篩選出抗潰瘍病的檸檬植株，并初步分析其抗病性狀的遺傳特征，為抗潰瘍病柑橘的選育打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為感潰瘍病檸檬品種尤力克。在尤力克成年樹開花前用防蟲網單株隔離，促使自花授粉，待果實成熟后，取出檸檬種子。在溫室播種獲得實生苗。研究鑒定的 114 株檸檬自交后代實生苗均保存在湖南農業大學國家柑橘改良中心長沙分中心的溫室內。

1.2 試驗方法

1.2.1 潰瘍病菌準備 取保存于 -80℃的潰瘍病菌液按“Z”字型劃線到 LB固體培養基，28℃活化培養 3 d。挑取單菌落于 20 mL LB 液體培養基中，在 28℃、200 r/min 的 搖 床 上 培 養 18 h。 取 活 化 菌 液 5 mL，7 500 r/min 離心 5 min，棄上清液，加入無菌水，重復此操作一次。在紫外分光光度計下用無菌水調節后測得 OD600為 0.6，再用無菌自來水重懸菌液濃度至108CFU/mL，并依次稀釋到 107、106、105、104、103、102和 10 CFU/mL 備用。

1.2.2 接種濃度的篩選 用最感病的冰糖橙和抗病的枸櫞 C-05 剛達到最大葉面積、未革質化的黃綠色健康新葉進行所有潰瘍病菌濃度的離體注射接種，以注射清水為對照，觀察冰糖橙和枸櫞 C-05 接種不同濃度菌液后的癥狀，最終選擇4個適宜濃度的潰瘍病菌液用于檸檬自交后代的抗性鑒定。

1.2.3 注射接種 選取剛達到最大葉面積、未革質化的黃綠色健康新葉進行離體注射接種，在同一葉片上分別接種不同濃度的潰瘍病菌液，以清水為對照。接種后的葉片置于干凈培養盒的濕潤濾紙上，封上保鮮膜，在 28℃恒溫光照條件下保濕培養，觀察葉片癥狀。每個處理重復3次，分別記錄每個濃度條件下，檸檬自交后代對潰瘍病的表現癥狀，出現明顯病斑（水漬狀、黃色暈圈、愈傷狀突起、病菌擴張）則為感病，出現壞死斑點（褐色壞死、病菌不擴張）則為抗病。以最為感病的冰糖橙和抗病的枸櫞 C-05 植株相同發育階段的葉片為對照。

1.2.4 針刺接種 從 70 株檸檬自交后代中選取剛達到最大葉面積、未革質化的黃綠色健康新葉進行離體針刺接種，用注射器針尖在葉面輕輕扎兩組小孔，每組 4 個，用被 108CFU/mL 潰瘍病菌菌液充分浸泡的帶菌小濾紙片覆蓋在針刺孔上，放置于干凈培養盒的濕潤濾紙上，封上保鮮膜，在 28℃恒溫光照條件下進行保濕培養，觀察葉片癥狀。以最感病的冰糖橙和抗病的枸櫞 C-05 為對照。每個處理重復 3 次試驗，分別記錄每組中明顯病斑數（愈傷狀突起）。發病率＝病斑數/總的針刺點數。

2 結果與分析

2.1 接種濃度的篩選

從圖1 中可以看出，冰糖橙注射 103CFU/mL 潰瘍病菌菌液后，出現零散愈傷狀突起癥狀 ；注射 104CFU/mL 菌液后，愈傷狀突起增加 ；注射 105CFU/mL菌液后，愈傷狀突起變為海綿狀，葉片開始潰敗；注射 106CFU/mL 菌液后，葉片潰敗，病斑擴張 ；注射更高的濃度的潰瘍病菌菌液后，葉片短時間內潰爛，無法進行觀察 ；注射清水后不發病。枸櫞 C-05 注射103CFU/mL 潰瘍病菌菌液后，出現壞死斑點 ；注射104CFU/mL 菌 液后，出現壞死斑塊 ；注射 105CFU/ mL 菌液后，壞死斑塊不擴張 ；注射 106CFU/mL 菌液后，病斑褐化壞死；注射清水后不發病。這說明選用 103、104、105和 106CFU/mL 的潰瘍病菌濃度對檸檬自交后代注射接種能看到從輕微發病到嚴重發病的癥狀范圍。因此，試驗確定如圖2所示進行注射接種。

2.2 注射接種鑒定結果

圖1 冰糖橙與枸櫞 C-05 接種不同濃度潰瘍病菌菌液后的癥狀表現（圖中上排為糖橙，下排為枸櫞 C-05）

圖2 注射接種濃度

試驗中發現，各處理葉片離體注射潰瘍病菌后，第4天便有部分葉片出現水漬狀斑點癥狀，隨后陸續有新病斑出現，且病斑不斷擴大 ；接種 7 d 后，不再有新的病斑出現 ；接種 10 d 后，所有葉片的病癥不再擴大。因此，選用注射接種 10 d 后葉片的癥狀表現對各處理植株進行抗病性的最后評價。從表1中可以看出，在離體注射接種的 114 株檸檬自交后代實生苗中，當注 射的菌 液 濃度 為 103CFU/mL 時， 有 55 株出現病癥，屬于感病植株；有59株沒有表現癥狀，屬于抗病單株，占鑒定總數的 51.75% ；當菌液濃度為 104CFU/mL 時，有 24 株沒有表現癥狀，屬于抗病單株，占鑒定總數的 21.05% ；當菌液濃度為 105CFU/mL 時，有7株沒有表現癥狀，屬于抗病單株，占鑒定總數的6.14% ；當 菌 液 濃 度 為 106CFU/mL 時， 所 有 檸 檬 自交后代實生苗均出現病癥。7 株抗 105CFU/mL 潰瘍病菌的植株分別為 NMZJ-47、NMZJ-80、NMZJ-144、NMZJ-202、NMZJ-343、NMZJ-383 和 NMZJ-39， 可以初步認定這7株檸檬為抗潰瘍病單株。部分檸檬自交后代注射潰瘍病菌 10 d 后的癥狀如圖3 所示。

表1 114 株檸檬自交后代注射接種鑒定結果

2.3 針刺接種鑒定結果

如圖4 所示，冰糖橙在 108CFU/mL 潰瘍病菌濃度下，所有針刺口出現愈傷狀突起，發病率為 100 %；枸櫞 C-05 在 108CFU/mL 潰瘍病菌濃度下，針刺口出現壞死狀斑點，發病率為0。

由表2可知，鑒定的70株檸檬自交后代實生苗中，在 108CFU/mL 潰瘍病菌濃度下，其中有 40 株發病率在 80%～100% 之間，有 16 株發病率在 60%～80%之間，有 3 株發病率在 40%～60% 之間，有 11 株發病率在 0%～40% 之間。由此可知，發病率在 40%～100 %之間的植株對潰瘍病表現為感病，植株數量為59株，占 鑒 定 總 數 的 84.28 % ；發 病 率 在 0%～40% 之 間 的植株對潰瘍病具有抗病性，植株數量為11株，占鑒定 總數的 15.71 %。這 11 株 抗病植株 分別為 NMZJ-47、NMZJ-80、NMZJ-100、NMZJ-144、NMZJ-160、NMZJ-172、NMZJ-222、NMZJ-343、NMZJ-383、NMZJ-39 和 NMZJ-191。 其 中，NMZJ-191 針 刺 接 種后的癥狀如圖4所示。

表2 70 株檸檬自交后代針刺涂菌接種鑒定結果

2.4 2 種鑒定結果的比較

圖3 部分檸檬自交后代注射接種 10 d 后的癥狀（121 為感病植株，386 可抗 103CFU/mL 的潰瘍病菌菌液，471 和 716 均可抗 104CFU/mL 的潰瘍病菌菌液）

圖4 針刺接種 108CFU/mL 潰瘍病菌后各品種的癥狀表現（從左至右依次為冰糖橙 BTC、檸檬自交 126 號、檸檬自交 191 號和枸櫞 C-05）

對比 2 種鑒定方法，發現注射接種表現為抗 104和 105CFU/mL 病原菌的植株與針刺接種表現為發病率在 0%～40% 之間的植株在抗病性上的差異較小，在田間對潰瘍病均表現為抗病。由注射接種法鑒定的 7 株抗 潰瘍 病（105CFU/mL） 植株 分別 為 NMZJ-47、NMZJ-80、NMZJ-144、NMZJ-202、NMZJ-343、NMZJ-383 和 NMZJ-39 ；由 針 刺 接 種法 鑒定 的 11 株抗 潰 瘍 病 植 株 分 別 為 NMZJ-47、NMZJ-80、NMZJ-100、NMZJ-144、NMZJ-160、NMZJ-172、NMZJ-222、NMZJ-343、NMZJ-383、NMZJ-39 和 NMZJ-191。 其中，有6株檸檬自交后代在2種鑒定方法中均被認定為抗病株。這表明這6株的抗潰瘍病性狀比較穩定，分別為 NMZJ-47、NMZJ-80、NMZJ-144、NMZJ-343、NMZJ-383 和 NMZJ-39。

3 小結與討論

通過大量田間調查和長期的栽培觀察發現，不同柑橘品種對柑橘潰瘍病的敏感性差異明顯[9-10]。在自然條件下，柑橘植株對潰瘍病的敏感性程度受到病原菌濃度及致病力、氣候條件、植物生長發育階段和人為因素等的影響。而實驗室離體接種鑒定能保證在病原菌濃度單因素變化條件下研究不同柑橘品種對潰瘍病的敏感性差異。離體葉接種法病癥表現較快，發病率較高，試驗過程不受外來因素的影響，操作簡單，結果可靠，而且試驗后菌源便于銷毀，可避免擴散。劉利平[11]通過比較針刺接種的發病癥狀、發病率、針刺接種 7 d 的病斑大小以及注射接種的病斑數來判斷不同柑橘品種對潰瘍病的耐抗性關系。該研究是通過對比注射接種和針刺接種2種離體接種方法對檸檬自交后代鑒定結果進行分析，注射接種法中表現為抗 104和 105CFU/mL 病原菌的植株有 24 株，針刺接種法中表現為抗 108CFU/mL 病原菌的植株有 11 株；其中，有6株檸檬自交后代在兩種鑒定方法中均被認定為抗病株，這6株的抗病性屬于比較穩定的。因此，綜合兩種鑒定方法，114 株檸檬自交后代對潰瘍病表現出不同程度的抗性，共有29株自交后代對潰瘍病表現出抗 104CFU/mL 病原菌。

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（責任編輯：成 平）

Vitro Identification of Lemon Self-crossed Seedlings for the Resistance to Citrus Canker Disease

TAN Li-mei1,2，LIU Hui1，ZHU Zhi-mei1,2，ZHOU Dong1，TANG Tian1，DENG Zi-niu1,2，
（1. Horticulture and Landscape College, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC; 2. National Center for Citrus Improvement, Changsha 410128, PRC）

For identifying lemon auto-seedling’s resistance to citrus canker, taking fresh lemon leaves as materials, susceptible Bingtang orange and the resistant citron C-05 as contrast, the resistance of 114 lemon self-crossed-seedlings were identified in vitro leaves, by injecting and needle puncturing different concentration of citrus canker. The results showed that there are differences on the resistance to citrus canker between the individual of lemon selfed progenies, 24 of them are resistant to 104and 105CFU/mL citrus canker by injection and 11 of them are resistant to 108CFU/mL citrus canker by needle puncture. Meanwhile, 6 of them are resistant to citrus canker by two methods. In conclusion, 114 lemon auto-seedlings performed variously faced citrus canker, and 29 of them are resistant to 104CFU/mL citrus canker.

bacterial canker disease; lemon self-crossed-seedlings; vitro inoculation; resistance evaluation

S666.5

A

1006-060X（2017）03-0058-05

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.003.017

2016-12-14

國家級大學生創新創業訓練計劃項目 [（G）SCX1506]

譚李梅（1993-），女，湖南資興市人，碩士研究生，研究方向：果樹遺傳育種與生物技術。

并列第一作者：劉 慧

鄧子牛