香芹酚和丁香酚對楊梅致病菌的抑菌作用

王雙輝，羅 林，羅麗娟，陳玲琳，金晨鐘

（1.湖南人文科技學院農(nóng)藥無害化應用重點實驗室，湖南 婁底 417000；2.湖南省農(nóng)田雜草防控技術與應用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 婁底 417000；3.湖南人文科技學院農(nóng)業(yè)與生物技術學院，湖南 婁底 417000）

香芹酚和丁香酚對楊梅致病菌的抑菌作用

王雙輝1,2,3，羅 林3，羅麗娟3，陳玲琳3，金晨鐘1,2,3

（1.湖南人文科技學院農(nóng)藥無害化應用重點實驗室，湖南 婁底 417000；2.湖南省農(nóng)田雜草防控技術與應用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 婁底 417000；3.湖南人文科技學院農(nóng)業(yè)與生物技術學院，湖南 婁底 417000）

試驗以香芹酚和丁香酚為原料，探討了不同濃度的植物精油對楊梅的保鮮效果；并從腐爛的楊梅中分離出楊梅致病菌，研究了植物精油對楊梅致病菌的抑菌效果；同時，以納米醇質(zhì)體為載體，制備植物精油新型納米防腐劑，考察其是否可以增強植物精油的抑菌效果。結(jié)果表明：16‰的香芹酚和丁香酚都能有效降低楊梅的腐爛指數(shù)，且香芹酚對楊梅的保鮮效果優(yōu)于丁香酚；4 株楊梅致病菌對 8% 的香芹酚和丁香酚都表現(xiàn)為極度敏感，且香芹酚對楊梅致病菌的抑菌效果優(yōu)于丁香酚；香芹酚-納米醇質(zhì)體對3株楊梅致病菌的抑菌活性強于同濃度的香芹酚。

植物精油；楊梅致病菌；香芹酚；丁香酚；抑菌

楊梅為我國南方的特產(chǎn)水果，年產(chǎn)量約 80萬～100 萬 t［1］。楊梅果實顏色鮮艷、香氣宜人、味道可口，是一種色香味俱全的水果，深受人們的喜愛。楊梅果實無表皮，易受到機械損傷，而且其成熟期正是梅雨季節(jié)，容易感染致病菌，因而儲藏期極短。生產(chǎn)中為了延長其儲藏時間，常使用化學藥劑進行保鮮。目前，常用的楊梅防腐保鮮劑有山梨酸鉀、庶糖酯、苯甲酸納、1- 甲基環(huán)丙烯和尼泊金乙酯等［2-4］。這些化學保鮮劑雖然可以延長楊梅的儲藏時間，但容易導致環(huán)境污染、生態(tài)系統(tǒng)破壞和對人畜毒害等問題［5］，已不再適應市場需求。因此，尋找安全高效的保鮮劑顯得十分重要［6］。

香芹酚和丁香酚是兩種常見的植物精油，分別散發(fā)出麝香草酚味和丁香味，能夠賦予食品香氣，矯正其異味，是一類食用安全的天然香料。同時，這2種物質(zhì)常溫下易揮發(fā)，有一定的抗菌生物活性，在果蔬防腐保鮮方面具有較好的應用前景［7-8］。納米醇質(zhì)體是一種特殊結(jié)構的納米粒［9］，具有獨特的表面效應和量子尺寸效應［10］，可以負載抗菌功能成分，形成一種新型納米防腐劑。試驗以香芹酚和丁香酚為原料，探討了不同濃度的植物精油對楊梅的保鮮效果，同時以納米醇質(zhì)體為載體，制備植物精油新型納米防腐劑，考察其對楊梅致病菌的抑制效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮楊梅，購自湖南婁底農(nóng)聯(lián)楊梅基地；香芹酚、丁香酚，購自阿拉丁試劑（上海）有限公司。

主要儀器有 ：Biosafer 250-88 超聲波細胞破碎儀（賽飛有限公司）；ZCL型數(shù)顯智能控濕磁為攬拌器；超凈臺 ；MIR-2W 恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同濃度精油對楊梅的浸泡保鮮試驗 將新鮮完整、無損傷飽滿的楊梅分為若干組，每組 500 g，分別在 0、1‰、2‰、4‰、8‰和 16‰的精油溶液中浸泡 5 min，瀝干，放入塑料筐內(nèi)，內(nèi)襯厚度為0.04 mm 的聚乙烯塑料，保鮮膜封口保溫，放置于20～25℃室溫下，8 d 后統(tǒng)計腐爛級別 I（I=0～3，判定標準［11］見表 1）以及各級別的果實數(shù) NI，計算腐爛指數(shù)。腐爛指數(shù) =∑（I×NI）/3×∑NI。

表1 腐爛級別判定標準

1.2.2 楊梅致病菌的分離與純化 在超凈臺中使用75% 的乙醇對所取腐爛楊梅表面消毒 4～5 min，用已滅菌小刀切取 5 mm 的腐爛組織小塊，無菌水沖洗切下的組織小塊 2～3 次，無菌濾紙擦干 ；將腐爛組織小塊放入 PDA 平板中［12］，28℃培養(yǎng) 3～5 d 至組織周圍長出菌落 ；選取楊梅組織附近的菌接種到新的 PDA培養(yǎng)基上，進一步純化直至產(chǎn)生單一菌落。將分離純化的菌種回接到新鮮的楊梅果實上，如發(fā)病癥狀與貯藏時的腐敗癥狀一致，即可作為楊梅致病菌［13］。

1.2.3 不同濃度精油對楊梅致病菌抑菌效果試驗 采用紙片擴散法［14］測定 1%、2%、4% 和 8% 的精油對楊梅致病菌的抑菌活性，抑菌活性判定標準［15］見表 2。

表2 抑菌活性判定標準

1.2.4 植物精油 -納米醇質(zhì)體的制備及抑菌效果 選用抑菌效果較好的香芹酚作為研究對象，將其制備成香芹酚濃度為 8% 的納米醇質(zhì)體，考察香芹酚 -納米醇質(zhì)體的抑菌活性，以普通的8%香芹酚精油為對照。納米醇質(zhì)體的制備過程 ：在錐形瓶中先后加入 15 mL乙醇、0.1 g 磷脂、0.01 g 乳化劑 -K、0.1 mL 吐溫 -80、0.1 g 精油，將其置于磁力攪拌器中混合共溶，30℃水浴和 1 000 r/min 的轉(zhuǎn)速下持續(xù)攪拌 2 min，密閉狀態(tài)注射器緩慢滴加純凈水 35 mL，再繼續(xù)攪拌 5 min，轉(zhuǎn)入 50 mL 離心管，冰浴下用超聲波細胞破碎儀探頭超聲 2 min（頻率為 5 s/次，開 4 s，停 1 s），即可獲得精油納米醇質(zhì)體［16］，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 精油濃度對楊梅腐爛指數(shù)的影響

由圖1所知，隨著植物精油濃度的升高，楊梅腐爛指數(shù)不斷降低 ；貯藏 8 d 后，空白組腐爛指數(shù)達到97.1%， 而 16‰ 香 芹 酚 處 理 組 腐 爛 指 數(shù) 僅 為 40.1%，16‰丁香酚處理組腐爛指數(shù)為 57.3%。由此可知，植物精油浸泡處理可以有效降低楊梅的腐爛程度，并且香芹酚的保險效果優(yōu)于丁香酚。

圖1 精油濃度對楊梅腐爛指數(shù)的影響

2.2 楊梅致病菌的分離與純化

按照常規(guī)的組織分離法從腐爛的楊梅果實內(nèi)分離出 4 株楊梅致病菌，將其分別命名為 LLC-1、LLC-2、LLC-3、LLC-4。各菌菌落形態(tài)特征如下 ：LLC-1 號菌為霉菌，呈乳白色，菌中間有突起點，表面粗糙，形狀不規(guī)則，邊緣為白色，從中心點向四周呈放射性的絲狀 ；LLC-2 號菌為霉菌，呈淡乳黃色，中間有明顯突起，菌絲從中心點向四周呈放射性的絲狀，絨毛狀；LLC-3 號菌為革蘭氏陰性菌，呈淡淡黃褐色，個體較小，扁圓形，表面光滑 ；LLC-4 號菌為酵母菌，呈乳黃色，菌落個體大而厚，表面光滑、濕潤、粘稠。

2.3 精油濃度對楊梅致病菌抑菌效果的影響

由表3可知，不同濃度的香芹酚和丁香酚對4株楊梅致病菌都有一定的抑制效果，抑菌圈的大小因植物精油種類、濃度和菌株而異。精油濃度越大，抑菌圈越大，抑菌活性越強，1% 和 2% 的香芹酚對 LLC-2、LLC-3、LLC-4 表現(xiàn)為中度敏感，對 LLC-1 為低度敏感 ；4% 的香芹酚對 LLC-1 和 LLC-2 為中度敏感，對 LLC-3 和 LLC-4 為高度敏感 ；8% 的香芹酚對 4 株菌都表現(xiàn)為極度敏感，抑菌圈大小都超過 30 mm。1%的 丁 香 酚 對 LLC-1、LLC-4 中 度 敏 感， 對 LLC-2 和LLC-3 為高度敏感 ；2% 的丁 香 酚 對 LLC-1、LLC-3、LLC-4 高度敏感，對 LLC-2 為極度敏感 ；4% 的丁香酚對 LLC-1 為高度敏感，對 LLC-2、LLC-3 和 LLC-4為極度敏感；8%的丁香酚對4株菌都表現(xiàn)為極度敏感。綜上所述，香芹酚和丁香酚對4株楊梅致病菌都有非常好的抑菌效果，且香芹酚抑菌效果優(yōu)于丁香酚。

表3 不同濃度精油處理楊梅致病菌抑菌圈大小的比較

2.4 植物精油 - 納米醇質(zhì)體對楊梅致病菌的抑菌效果

如表4 所示，8% 的香芹酚 -納米醇質(zhì)體對楊梅致病菌 LLC-1、LLC-3 和 LLC-4 的抑菌活性比同濃度的香芹酚有所增強，抑菌圈分別增大了 5.07、4.54、4.68 mm ；而 8% 的香芹酚 - 納米醇質(zhì)體對楊梅致病菌LLC-2 的抑菌活性比同濃度的香芹酚有所減弱，抑菌圈縮小了 7.85 mm。

表4 香芹酚 -納米醇質(zhì)體對楊梅致病菌的抑菌效果

3 結(jié) 論

以香芹酚和丁香酚兩種常見的植物精油為材料，研究了不同濃度精油浸泡處理對楊梅的保鮮效果，結(jié)果表明：兩種植物精油都能夠有效降低楊梅的腐爛率，且濃度越高，保鮮效果越好 ；貯藏 8 d 后，空白組腐爛指數(shù)達到 97.1%，而 16‰香芹酚和 16‰丁香酚處理組的腐爛指數(shù)分別為 40.1% 和 57.3%，比空白組降低了 57 和 39.8 個百分點。試驗從腐爛楊梅果實中分離純化出 4 株楊梅致病菌，其中，LLC-1 和 LLC-2 為霉菌，LLC-3 為細菌，LLC-4 為酵母菌。利用紙片擴散法研究了不同濃度香芹酚和丁香酚對4株楊梅致病菌的抑菌效果。結(jié)果表明，香芹酚和丁香酚對4株楊梅致病菌都有非常好的抑菌效果，當濃度為 8%時，對4株菌株均表現(xiàn)為極度敏感，且香芹酚的抑菌效果優(yōu)于丁香酚。

另外，試驗還探討了香芹酚-納米醇質(zhì)體對楊梅致病菌的的抑菌效果。結(jié)果表明，與同濃度的香芹酚相比，8% 的香芹酚 -納米醇質(zhì)體對楊梅致病菌 LLC-1、LLC-3 和 LLC-4 的抑菌圈分別增大了 5.07、4.54、4.68 mm，而對楊梅致病菌 LLC-2 的抑菌圈縮小了 7.85 mm，其原因有待進一步研究。

［1］ 謝煥雄，王海鷗，胡志超，等 . 我國楊梅生產(chǎn)與貯藏加工現(xiàn)狀 ［J］.食品研究與開發(fā)，2007，128（6）：124-126.

［2］ 柴春燕，陳利江，江建遠 . 噴灑 CAP-10 等防腐劑對楊梅保鮮試驗［J］. 上海農(nóng)業(yè)科技，1999，（4）：76-79.

［3］ 王益光，林美士 . 楊梅化學防腐保鮮試驗初報 ［J］. 中國南方果樹，2002，（31）：26.

［4］ 茅林春，方雪花，龐華卿 . 1-MCP 對楊梅果實采后生理和品質(zhì)的影響 ［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學，2004，37（10）：1532-1536.

［5］ Bouwmeester H，Dekkers M Y，Noordam W I，et al. Toxicol［J］. Pharmacol，2009，53 ：52-62.

［6］ 鞏衛(wèi)琪 . 香芹酚 -β- 環(huán)糊精包合物的制備及對楊梅果實的緩釋保鮮研究 ［D］. 南京 ：南京農(nóng)業(yè)大學，2010.

［7］ Sivakumar D，Bautista-Banos S. Areview on the use of essential oils for postharvest decay control and maintenance of fruit quality during storage［J］. Crop Protection，2014，64 ：27-37.

［8］ 吳 新 . 植物精油對草莓和楊梅果實保鮮的作用及機理研究 ［D］.合肥 ：安徽農(nóng)業(yè)大學，2014.

［9］ Touitou E，Godin B，Weiss C. Enhanced delivery of drugs into and across the skin by ethosomal carriers［J］. Drug Development Research，2000，50 ：406-415.

［10］ Jiang W，Kim B Y S，Rutka J T，et al. Nanoparticle mediated cellular response is size-dependent［J］. Nature Nanotechnology，2008，3 ：145-150.

［11］ Chen H J，Yang H，Gao H Y，et al. Effect of hypobaric storage on quality，antioxidant enzyme and antioxidant capability of the Chinese bayberry fruits［J］. Chemistry Central Journal，2013，7（1）：4-5.

［12］ 張 玲 . 微 生 物學實 驗 指 導 ［M］. 北 京 ：清 華 大 學出版 社，2010. 18-19.

［13］ 方 中 達 . 植病研究方法（第 S 版）［M］. 北 京 ：中 國 農(nóng)業(yè)出版社，1998. 113-115.

［14］ 周幫靖 . 常用中藥的抑菌作用及其測定方法 ［M］. 重慶 ：科技文獻出版社重慶分社，1987. 289-231.

［15］ 蔡一鳴，任榮清，文正常 . 中藥方劑的抑菌試驗 ［J］. 貴州畜牧獸醫(yī)，1995，19（4）：4-5.

［16］ 劉 紅 . EGCG 納米醇 質(zhì) 體 的制備及其抗紫 外 輻 射增效研究 ［D］.杭州 ：浙江工商大學，2015.

（責任編輯：成 平）

Inhibition Effects of Carvacrol and Eugenol on Bayberry Pathogens

WANG Shuang-Hui1,2,3，LUO Lin3，LUO Li-juan3，CHEN Ling-lin3，JIN Chen-zhong1,2,3
（1. Key Laboratory of Pesticide Hurmless Application, Hunan University of Humanities, Science and Technology, Loudi 417000, PRC; 2. Hunan Provincial Collaborative Innovation Center for Field Weeds Control, Loudi 417000, PRC; 3. College of Agriculture and Biotechnology, Hunan University of Humanities, Science and Technology, Loudi 417000, PRC）

Carvacrol and eugenol, two plant essential oils, are used to study the preservation effect of red bayberry, and bayberry pathogens are isolated from rotten red bayberry, then the effect of plant essential oil on the inhibition of bayberry pathogens is studied. Meanwhile, the plant essential oils are prepared into nano-ethosomes, to explore whether it could enhance the antibacterial effect of plant essential oils. The results showed that 16‰ carvacrol and eugenol effectively reduce the decay index of bayberry, and preservation effect of carvacrol is better than that of eugenol, four bayberry pathogens are extremely sensitive to 8% carvacrol and eugenol, and the antibacterial effect of carvacrol is better than that of eugenol. In addition, the antimicrobial activity of carvacrol nano-ethosome on three strains is better than that of the same concentration of carvacrol.

plant essential oil; bayberry pathogen; carvacrol; eugenol; bacteriostasis

S482.2+95

A

1006-060X（2017）03-0063-03

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.003.018

2016-12-29

湖南省教育廳科技計劃項目（2017-1114）；湖南人文科技學院青年基金項目（2015QN10）；湖南省高校創(chuàng)新平臺開放基金（15K066）作者簡介：王雙輝（1985-），男，湖南雙峰縣人，助教，主要從事食品微生物與天然產(chǎn)物利用研究。

金晨鐘