γ-干擾素釋放試驗對活動性肺結核的輔助診斷價值

曾誼 李太順 宋梅梅 黃磊

·論 著·

γ-干擾素釋放試驗對活動性肺結核的輔助診斷價值

曾誼1李太順2宋梅梅1黃磊1

目的 探討結核分枝桿菌感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)在活動性肺結核中的診斷價值。方法 應用T-SPOT.TB試劑盒對153例活動性肺結核(A組)和81例其他肺部疾病(B組)患者的外周血中MTB特異性T淋巴細胞進行檢測，同時對兩組患者進行LAM、16KD、38KD抗體的檢測。結果 T-SPOT.TB對活動性肺結核的敏感性為78.4% (120/153)，要明顯高于對照組24.7% (20/81)(χ2=80.91，P<0.001)。T-SPOT.TB檢測的敏感性要明顯高于16KD抗體10.5%(χ2=52.26，P<0.001)、也要高于38KD抗體(54.9%)、LAM抗體(58.8%)，但其差異無統計學意義(χ2=0.62、χ2=0.50，P值均>0．05)。T-SPOT.TB檢測的特異性為75.3%(61/81)，要低于16KD抗體84.0%(68/81)(χ2=5.59，P<0.05)；也要低于38KD抗體80.2%(65/81)和LAM抗體81.5%(65/81)，但差異無統計學意義(χ2=0.45、χ2=0.50，P值均>0.05)。菌陽患者的ESAT-6、CFP-10的SFC分別為47.10±34.53和63.02±35.92，要明顯高于菌陰肺結核(P<0.05、P<0.01)。重癥患者的ESAT-6、CFP-10的SFC分別為60.84±31.76和74.75±33.75，明顯高于輕癥患者(P<0.001)。通過受試者工作特征曲線(ROC曲線)，當EAST-6的SFC取值21.5時最具診斷價值，其靈敏度為74.8%，特異度為94.5%；CFP-10取值19.5時最具診斷價值，靈敏度為77.6%，特異度為91.8%。結論 T-SPOT.TB 對活動性肺結核的診斷有一定的價值，和其他血清學結核抗體檢測相比有一定的優勢，但并不十分突出。兩種抗原的SFC值與疾病的輕重程度相關，SFC的具體數值有一定的臨床價值和意義。

結核/診斷；γ-干擾素釋放試驗；酶聯免疫斑點測定；蛋白芯片技術

γ-干擾素釋放試驗(IGRAs)作為結核病體外免疫診斷技術正式在中國用于臨床診斷已經有六年了。中華醫學會結核病學分會在2014年發布的γ-干擾素釋放試驗在中國的應用建議[1]中指出：IGRAs是檢測結核分枝桿菌(MTB)特異性抗原刺激T細胞產生的γ-干擾素(IFN-γ)，可用于診斷MTB潛伏感染(1atent tuberculosis infection，LTBI)。而臨床上我們最關注的是IGRAs對于活動性肺結核的診斷價值，對此，國內的研究結果不盡相同，而且試驗方法、樣本量和入組標準也不一致，難以完整的詮釋IGRAs的臨床價值。

目前IGRAs的檢測方法有兩種[2]：① 采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)：檢測全血中致敏T細胞再次受到MTB特異性抗原刺激后釋放的IFN-γ水平，稱之為全血檢測或結核感染T細胞免疫檢測；② 采用結核分枝桿菌感染T細胞斑點試驗：測定在MTB特異性抗原刺激下，外周血單個核細胞中釋放IFN-γ的效應T細胞數量，稱之為T-SPOT.TB。本研究擬采用T-SPOT.TB的方法來進一步說明IGRAs對活動性肺結核的診斷價值，以及T-SPOT.TB檢測具體數值的臨床意義，及其與疾病嚴重程度之間的關系。

資料和方法

一、 研究對象

1 活動性肺結核組(A組)：2015年8月至2016年1月，南京市胸科醫院結核鑒別診斷科住院的活動性肺結核病人153例，男性85例，女性68例，男女比例為1.25 ∶1，平均年齡(49.6±12.3)歲(18-77歲)。

A組中菌陽肺結核(65例)，菌陰肺結核(88例)，均按中華醫學會2005年頒布的《臨床診療指南.結核病分冊》[3]的相關標準進行診斷。菌陽肺結核：直接痰涂片鏡檢抗酸桿菌陽性或結核分枝桿菌培養陽性；菌陰肺結核：① 典型的結核臨床癥狀和胸部X線表現；② 抗結核治療有效；③ 臨床可排除其他非結核肺部病變；④ PPD試驗強陽性；血清MTB抗體(MTB-AB)陽性；⑤ 痰MTB PCR+探針檢測呈陽性；⑥ 肺外組織病理證實結核病變；⑦ 支氣管肺泡灌洗液(BALF)檢出MTB；⑧ 支氣管或肺部組織病理證實為結核病變。具備1-6中3項或7、8中1項可以確診。

同時，按癥狀輕重、病程長短及病變范圍又劃分為輕癥組(80例)和重癥組(73例)，輕癥組為初發病人，查體發現肺部病灶或有輕度臨床癥狀，X線檢查提示浸潤性病灶累及一側肺的1至2個肺葉；重癥組有明顯的結核中毒癥狀，病程較長，X線檢查提示病灶累及3個肺葉以上，或伴有空洞形成[4]。

2 非結核呼吸系統疾病對照組(B組)：同期在南京市胸科醫院呼吸內科及鑒別診斷科的住院患者81例，包括原發性支氣管肺癌、支氣管肺炎、大葉性肺炎、支氣管擴張、慢性支氣管炎、特發性肺間質纖維化、細菌性肺膿腫等，均取得病理學或病原學診斷依據，且排除肺結核或肺外結核病。其中男46例，女35例，男女比例為1.31 ∶1；平均年齡(51.2±11.6)歲(23-80歲)。

二、檢測方法

1 T-SPOT.TB檢測方法：按T-SPOT.TB試劑盒(上海復星科技有限公司)操作規范進行。取患者靜脈血6 mL， 6小時內分離外周血單個核細胞(PBMC)，用細胞培養基AIM-V(GIBCO公司)重懸細胞，并將濃度調整至2.5×106/mL。在已包被抗IFN-γ單抗的96個孔板上，分別單孔加入50 μL細胞培養基作為空白對照，50 μL植物血凝素作為陽性對照，每孔加入50 μL MTB特異性早期分泌靶抗原6(ESAT-6)和培養過濾蛋白10(CFP-10)肽段庫(終濃度10 μg/mL)作為刺激原(Oxford，英國)。然后在每個孔中加入100 μL上述細胞懸液。37℃孵箱培養16-20h后，用PBS緩沖液(GIBCO公司)洗板4次，加入堿性磷酸酶標記的二抗50 μL，在2-8℃下孵育1h，孵育后再用PBS緩沖液洗板4次。最后每孔加入顯色底物液5-溴-4-氯-3吲哚-磷酸鹽-四氮唑蘭50 μL，室溫中靜置7 min后去離子水終止反應。觀察結果，并用ELISPOT計數儀(KS Elispot version 4.9，ZEISS，德國)計算MTB感染T淋巴細胞所對應的斑點數(SFC)。

結果判定：據測試孔A(ESAT-6)和/或測試孔B(CFP-10)的反應來判斷結果：如果陰性對照孔SFC為0-5，(測試孔A和/或B SFC)-(陰性對照孔SFC)≥6視為陽性；當陰性對照孔SFC≥6，(測試孔A和/或B SFC)≥2*(陰性對照孔SFC)視為陽性[5]。

2 結核抗體檢查:試驗儀器和試劑采用南京大淵生物技術工程有限責任公司生產的PBT-X4型生物芯片識別儀和結核分枝桿菌IgG抗體檢測試劑盒(蛋白芯片)，采用蛋白芯片法檢測血清LAM、16KD、和38KD抗體水平，取靜脈血5mL，分離血清，具體的操作步驟嚴格按照試劑盒說明進行。

三、統計學方法

采用SPSS19.0版統計學軟件進行分析，分類資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，以P<0.05有統計學意義，應用SPSS中的受試者工作特性曲線(receiver operator characteristic curve，ROC曲線)，進行科學評價，把方法的靈敏度與特異度結合分析。

結 果

一、T-SPOT.TB在兩組中的檢測結果

A組T-SPOT.TB檢測陽性的例數是120例，占78.4%，B組的陽性例數是20例，占24.7%，兩組對比A組明顯高于B組，差異有統計學意義，χ2=80.91，P<0.001。T-SPOT．TB檢測在活動性肺結核診斷中的敏感度為78.4%，特異度為75.3%(見表1)。

表1 T-SPOT.TB在兩組中的檢測結果

二、T-SPOT.TB與MTB抗體的比較

兩組患者分別進行T-SPOT.TB檢測和MTB 16KD、38KD、LAM抗體的檢測，結果(見表2)。T-SPOT.TB檢測對活動性肺結核診斷的敏感性為78.4%，要明顯高于16KD抗體(10.5%)(χ2=52.26，P<0.001)、也高于38KD抗體(54.9%)、LAM抗體(58.8%)，但其差異無統計學意義(χ2=0.62、χ2=0.50，P值均>0.05)。T-SPOT.TB檢測的特異度為75.3%，要低于16KD抗體84.0%，兩者相比較有統計學意義(χ2=5.59，P<0.05)；也低于38KD抗體(80.2%)和LAM抗體(81.5%)，但差異無統計學意義(χ2=0.45、χ2=0.50，P值均>0.05)。

三、T-SPOT.TB在菌陽肺結核和菌陰肺結核檢測結果的比較

菌陽肺結核組中，ESAT-6的SFC為47.10±34.53，要明顯高于菌陰肺結核的32.87±21.79(t=2.231P<0.05)；CFP-10在菌陽肺結核組的SFC為63.02±35.92，也要高于菌陰肺結核的39.12±28.11(t=3.04P<0.01)。提示T-SPOT.TB的檢測結果在菌陽和菌陰肺結核中有明顯的差異。(見表3)。

表2 T-SPOT.TB與16KD、38KD、LAM抗體的比較

a: T-SPOT.TB與16KD抗體比較，χ2值為52.26，P<0.001；與16KD、38KD抗體比較χ2值分別為0.62、0.50，P值均>0.05。b: T-SPOT.TB與16KD抗體比較，χ2值為5.59，P<0.05；與16KD、38KD抗體比較χ2值分別為0.45、0.50，P值均>0.05

表3 T-SPOT.TB在菌陽肺結核和菌陰肺結核檢測結果的比較

四、T-SPOT.TB在重癥和輕癥肺結核檢測結果的比較

重癥組中，ESAT-6的SFC為60.84±31.76，要明顯高于輕癥組的18.71±8.66(t=7.912P<0.001)；CFP-10在重癥組的SFC為74.75±33.75，也要高于輕癥組的25.61±15.17(t=7.178P<0.001)。提示T-SPOT.TB的檢測對于活動性肺結核不同的病變程度，其檢測結果亦有顯著的差異。(見表4)

表4 T-SPOT.TB在輕癥和重癥肺結核檢測結果的比較

五、應用ROC曲線說明T-SPOT.TB對活動性肺結核的診斷價值

根據A組、B組中T-SPOT.TB檢測的SFC數值，可分別得到ESAT-6和CFP-10的ROC工作曲線(見圖1)，其中ESAT-6的ROC曲線下面積為0.895，標準誤為0.021，95%的漸近置信區間為(0.854，0.936)，當EAST-6取值21.5時最具診斷價值，其靈敏度為74.8%，特異度為94.5%；CFP-10的ROC曲線下面積為0.886，標準誤為0.022，95%的漸近置信區間為(0.844，0.929)，當CFP-10取值19.5時最具診斷價值，靈敏度為77.6%，特異度為91.8%。

T1:ESAT-6,T2:CPT-10

討 論

T-SPOT.TB現已被公認為是檢測MTB感染的診斷技術。其技術原理是機體感染MTB后，血液中的記憶性T淋巴細胞和單核細胞會在再次接觸MTB特異性抗原時產生和分泌相應的細胞因子(IFN-γ)。在體外試驗時，選取了存在于MTB，但在卡介苗和大多數非結核分枝桿菌中普遍缺少的RDl區編碼的ESAT-6和CFP-10蛋白作為刺激抗原，刺激受試者外周血中的T淋巴細胞，通過酶聯免疫斑點技術，計數分泌IFN-γ的T淋巴細胞數量來判斷是否存在MTB特異性活化的效應T細胞，進而判斷是否存在結核分枝桿菌感染。根據多項研究結果證實T-SPOT.TB在LTBI的診斷中有著較高的敏感性和特異性[6-7]，該試驗已被CDC推薦作為篩查及診斷結核分枝桿菌感染的方法之一[8]。

作為臨床醫生我們更關注的是T-SPOT.TB對于活動性肺結核的診斷價值，目前，國外有文獻報道，T-SPOT.TB在中/低收入國家診斷肺結核的綜合敏感度為83%(95%CI為63%-94%)，綜合特異度為61%(95%CI為40%-79%)[9]。國內多數研究結果提示，T-SPOT.TB檢測對疑似肺結核的診斷敏感度為77%-95%，特異度為71.7%-93%[10-12]。本研究應用T-SPOT.TB的方法對153例活動性肺結核患者和81例非結核其他肺部疾病患者的外周血單個核細胞進行檢測，結果顯示T-SPOT.TB對于活動性肺結核的敏感性為78.4%(120/153)，特異性為75.3%(61/81)，與上述研究結果相符，進一步證實T-SPOT.TB對活動性肺結核的診斷是有一定參考價值的。本研究還將T-SPOT.TB與MTB的LAM、16KD、38KD抗體水平檢測做了比較，結果顯示：T-SPOT.TB檢測在活動性肺結核的敏感性(78.4%)，要高于LAM抗體的58.8%(90/153)和38KD抗體的54.9%(84/153)，但差異無統計學意義(P>0.05)，明顯高于16KD抗體10.5%(16/153)，P<0.001。T-SPOT.TB檢測的特異性(75.3%)與LAM抗體81.5%(65/81)及38KD抗體80.2%(65/81)的檢測結果相似，差異無統計學意義(P>0.05)，說明T-SPOT.TB檢測對于活動性肺結核的診斷對比蛋白芯片技術檢測MTB抗體(LAM、38KD)有一定的優勢，但并不十分明顯。16KD抗體檢測的特異性雖然比較高84.0%(68/81)，但其敏感性過低，所以作者認為不太適合將其單獨作為診斷活動性肺結核的指標，其價值應該體現在與其他指標聯合檢測，提高診斷的特異性上。

T-SPOT.TB檢測中，ESAT-6和CFP-10的SFC數值代表受到MTB特異性抗原刺激后，外周血單核細胞中釋放IFN-γ的效應性T淋巴細胞的數量，SFC數值越高提示參與免疫應答的T淋巴細胞越多，細胞免疫越活躍。最近有研究顯示，活動性肺結核較非活動性肺結核IFN-γ釋放試驗有更高的應答，IFN-γ釋放反應的量值可直接反映出MTB特異性抗原的負荷[13]。本研究結果顯示：痰菌陽性患者的ESAT-6、CFP-10的SFC分別為47.10±34.53和63.02±35.92，要明顯高于菌陰肺結核，其差異有統計學意義(P<0.05、P<0.01)。在重癥肺結核組中，ESAT-6、CFP-10的SFC分別為60.84±31.76和74.75±33.75，也要明顯高于輕癥組(P<0.001)。故考慮，T-SPOT.TB檢測中兩種特異性抗原的SFC數值與肺結核病灶的嚴重程度和MTB的菌量負荷相關。在菌陽和病變范圍廣泛的病例中，機體對MTB特異性抗原的免疫應答能力增強，因此表現為受抗原刺激后釋放IFN-γ的T細胞斑點數增高。

目前T-SPOT.TB是以兩個特異性抗原刺激后，T淋巴細胞的SFC的具體數值作為定量的表達，本研究通過受試者工作特征曲線(ROC曲線)，以SFC為分界值用于鑒別活動性肺結核和非肺結核的其他疾病，發現當EAST-6取值21.5時最具診斷價值，其靈敏度為74.8%，特異度為94.5%；CFP-10取值19.5時最具診斷價值，靈敏度為77.6%，特異度為91.8%，為進一步分析T-SPOT.TB的試驗結果提供了依據。

總之，T-SPOT.TB 檢測對活動性肺結核的診斷有較高的敏感性和特異性，和其他臨床常用的血清學結核抗體檢測指標相比較有一定的優勢，但并不十分突出。兩種抗原的SFC值與疾病的輕重程度相關，且SFC的具體數值有一定的臨床價值和意義。但由于本試驗的樣本量偏少，要得出SFC值的具體影響因素，諸如，年齡、合并癥等，尚需更大樣本量的研究。

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Auxiliary diagnostic value of interferon-gamma release assay for active tuberculosis

ZENGYi,LITai-shun,SONGMei-mei,HUANGLei

DepartmentofTuberculosisInfection,NanjingChestHospital,Nanjing,Jiangsu210029,China

Objective To study the auxiliary diagnostic value of T-SPOT.TB for active tuberculosis. Methods Rapid T-SPOT.TB assay was employed to detect Mycobacterium tuberculosis antigen specific T cells in blood samples from 153 cases with pulmonary tuberculosis (the A group) and 81 cases with non TB pulmonary disease (the B group), and also the antibody LAM, 16KD and 38KD in the two groups was detected by proteinchips. Results The sensitivity of T-SPOT.TB assay in active pulmonary tuberculosis was 78.4% (120/153), and it was significantly higher than 24.7% of the B group (20/81) (χ2=80.91,P<0.001). The sensitivity of T-SPOT.TB assay was higher than that of tuberculosis antibody 16KD [10.5% (χ2=52.26,P<0.001)], but there was no statistical significance (χ2=0.62, χ2=0.50,P>0.05) compared with antibody 38KD (54.9%) and antibody LAM (58.8%). The specificity of T-SPOT.TB assay was 75.3% (61/81), lower than antibody 16KD [84.0% (χ2=5.59,P<0.05)], but there was no statistical significance (χ2=0.45, χ2=0.50,P>0.05) compared with antibody 38KD (80.2%) and antibody LAM (81.5%). SFC count of ESAT-6 and CFP-10 in smear and culture positive pulmonary tuberculosis was respectively 47.10±34.53 and 63.02±35.92, and it was significantly higher than that in smear and culture negative pulmonary tuberculosis (P<0.05,P<0.01). SFC count of ESAT-6 and CFP-10 in severe patients was respectively 60.84±31.76 and 74.75±33.75, and it was significantly higher than that in mild patients (P<0.001). When the critical value of SFC count of ESAT-6 by ROC curve was 21.5, the sensitivity was 74.8%, and the specificity was 94.5%. When the critical value of SFC count of CFP-10 by ROC curve was 19.5, the sensitivity was 77.6%, and the specificity was 91.8%. Conclusion Compared with serum tuberculosis antibody tests, T-SPOT.TB assay has a certain value in the diagnosis of active tuberculosis. SFC count of ESAT-6 and CFP-10 is correlated with the severity of the disease, and the specific value of SFC count has certain clinical significance.

tuberculosis/diagnosis; interferon-gamma release assay; enzyme-linked immunospot assay; proteinchips

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.05.001

南京市醫學科學發展項目(No ykk15169)

1. 210029 江蘇 南京，南京市胸科醫院結核科 2. 210009 江蘇 南京，東南大學公共衛生學院

2016-07-01]