PAs/PAI—1在膜性腎病腎組織中的動態表達及意義

梁靜+張淵+孟祥龍+趙玉容+王莉

摘要：目的 建立膜性腎病（MN）大鼠模型，觀察PAs/PAI-1在不同時間點腎組織中的動態表達規律，探討PAs/PAI-1在MN發生過程中的意義。方法 將30只SD雄性大鼠隨機分為正常組和模型組，正常組不給予任何處理，模型組按改良Border法[1]，尾靜脈注射16 mg/kg C-BSA復制MN大鼠模型，于正式免疫第1、2、3、4 w取材，取材前收集24 h尿，定量動態檢測24 h尿蛋白水平（24hUTP），取大鼠腎組織進行光鏡、電鏡及免疫熒光鑒定成模情況，免疫組化方法動態檢測腎組織中t-PA、u-PA、PAI-1的表達。結果 ①模型組大鼠腎臟病理損害隨時間延長逐漸加重。②模型組第2 w起24 h尿蛋白水平顯著高于正常組（P<0.05）。③模型組腎組織中t-PA、u-PA表達隨時間延長呈下降趨勢，PAI-1表達隨時間延長呈上升趨勢；t-PA表達較正常組降低，PAI-1表達較正常組升高，u-PA第1 w末出現短暫升高，以后較正常組降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論 腎組織PAs/PAI-1表達失衡是導致MN病理損害、加重蛋白尿發生發展的重要因素。

關鍵詞：陽離子化牛血清白蛋白（c-BSA）；膜性腎病（MN）；組織型纖溶酶原激活物（t-PA）；尿激酶型纖溶酶原激活物（u-PA）；纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）

Abstract：Objective To establish a membranous nephropathy（MN） rat model，dynamic observation of PAs/PAI-1 in the renal tissue at different time points in the expression pattern of PAs/PAI-1，in the production of MN.Methods 30 male SD rats were randomly divided into normal group and model group，the normal group was not given any treatment，model group according to the modified Border method[1]，tail vein injection of 16 mg/kg C-BSA replication model of MN rats，1，2，3，4 w in the official immunity，were collected before 24 h urine，24 h urinary protein quantitative dynamic detection level（24hUTP），renal tissue of rats were studied by light microscopy，electron microscopy and immunofluorescence identification model.T-PA，the kidney tissue was detected with immunohistochemical method in dynamic u-PA，the expression of PAI-1.Results ①The renal pathological damage of rats in model group were aggravated with time.②The model second w 24 h urinary protein level was significantly higher than the normal group （P<0.05）.③The renal tissue of t-PA model group，u The expression of-PA decreased with time，the expression of PAI-1 increased with time； the expression of t-PA decreased compared with the normal group，the expression of PAI-1 increased compared with normal group，u-PA first w appeared at the end of a transient increase，then decreased compared with the normal group，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion The expression of PAs/PAI-1 is the result of imbalance the pathological damage of MN，the important factor to worsen the occurrence and development of proteinuria.

Key words：Cationic bovine serum albumin（c-BSA）；Membranous nephropathy（MN）；Tissue type plasminogen activator（t-PA）；Urokinase type plasminogen activator （u-PA）；Plasminogen activator inhibitor-1（PAI-1）

1 資料與方法

1.1實驗材料 牛血清白蛋白（購自國藥集團化學試劑成都有限公司）；羊毛脂、液體石蠟、碳化二亞胺（購自廈門星隆達化學試劑公司）；PASM染色試劑盒、Masson染色試劑盒、t-PA、u-PA、PAI-1免疫組化試劑盒（購自福州邁新生物試劑有限公司）；兔抗大鼠IgG多克隆抗體及異硫氰酸熒光素標記羊抗兔熒光抗體（北京博奧森生物技術有限公司提供）。

1.2模型制備與分組 成年健康雄性SD大鼠30只，適應性喂養7 d后檢測24 h UTP，均<5 mg。隨機分為正常組（10只）和模型組（20只）兩組。參照改良Border方法，用c-BSA制作大鼠膜性腎病模型，將牛血清白蛋白經碳化二亞胺處理后制成陽離子化牛血清白蛋白（C-BSA），模型組大鼠每只取C-BSA 1 mg溶解于0.5 ml生理鹽水中與等量不完全弗氏佐劑（自備）充分乳化，在大鼠頸背部皮下多點注射作預免疫。預免疫1 w后正式免疫，每只造模大鼠隔日尾靜脈注射C-BSA（16 mg/kg），連續4 w，正常對照組大鼠隔日尾靜脈注射等體積NS，均連續4 w。

1.3實驗方法及檢測指標

1.3.1模型鑒定 每組于正式免疫第1、2、3、4 w將大鼠處死取材，取材前收集24 h尿，記錄尿量，檢測24 h尿蛋白水平[2]（24h UTP），取材觀察腎臟大小及顏色；同時取相應腎組織進行光鏡、電鏡及免疫熒光檢測，觀察腎組織病理改變情況。

1.3.2檢測指標及方法 ①免疫熒光：采用間接免疫熒光法檢測腎組織IgG表達；②免疫組化：參照說明書，采用SP法，檢測腎組織t-PA、u-PA、PAI-1的表達，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，以腎實質細胞胞漿內棕褐色顆粒為陽性，在高倍視野下隨機選取面積相似的10個腎小球，應用計算機病理圖像處理系統對選取的腎小球內u-PA、t-PA、PAI-1免疫組化陽性信號進行圖像分析，計算陽性面積平均值，結果以陽性面積×陽性強度表示[3-4]。③GBM厚度的檢測：透射電鏡下觀察腎小球超微結構，GBM厚度以5條以上的基底膜厚度的平均值表示，采用立體計量法測量GBM厚度[5]。

1.4統計學方法 全部數據采用SPSS17.0 for windows軟件包統計分析，結果用（x±s）表示，兩組間樣本均數比較采用t檢驗，各時間點比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1一般情況 造模后模型組全部大鼠逐漸出現消瘦、懶動、納差，毛發脫落，抓持反抗能力明顯減弱，部分大鼠出現腹水，陰囊水腫。腎組織較正常腎臟增大，包膜緊張，色稍白，雙腎呈“大白腎”外觀。

2.2動物模型檢測結果 模型組：24 h尿蛋白逐漸增多，第2 w起各時間點較正常組差異顯著（P<0.05），見表1；第2 w起隨試驗時間延長，腎小球毛細血管壁熒光強度逐漸增強；光鏡下可見腎小球腫大，球囊腔狹窄，腎小球毛細血管壁彌漫性增厚，GBM外側“釘突”形成，上皮下大量顆粒狀紅染沉積物，腎小管管腔狹窄，上皮腫脹；電鏡下可見GBM彌漫增厚，足突變平、部分融合，上皮下可見分布不均的顆粒狀電子致密沉積物。正常組無上述改變，見圖1。

2.3腎組織t-PA、u-PA、PAI-1的檢測結果 t-PA主要表達在血管內皮細胞、腎小管上皮細胞、腎小球系膜細胞胞漿；u-PA主要表達在腎小管上皮細胞胞漿；PAI-1主要表達在血管平滑肌細胞、腎小管上皮細胞胞漿，而腎小球系膜細胞及腎間質表達極少。模型組自實驗第2 w起各時間點t-PA表達較正常組減少（P<0.05），并呈下降趨勢；PAI-1表達較正常組增多（P<0.05），呈上升趨勢；u-PA于第1 w末出現短暫升高，以后呈下降趨勢，各時間點表達較正常組差異明顯（P<0.05），見表2，以第4w為例，見圖2。

2.4腎組織PAs/PAI-1的結果 正常組：t-PA/PAI-1比值維持在一個較高水平，PAs/PAI-1比值恒定，各時間點比較無差異。模型組：PAs/PAI-1比值隨時間延長呈逐漸下降趨勢，t-PA/ PAI-1比值第2 w起較正常組差異明顯，u-PA/PAI-1比值各時間點較正常組差異明顯，差異均有統計學意義（P<0.05），見表3。

2.5腎組織GBM厚度檢測 模型組：各時間點GBM較正常組顯著增加（P<0.01）；隨實驗時間的延長，GBM呈逐漸增厚趨勢，各時間點差異明顯，具有統計學意義（P<0.05），見表4。

3 討論

MN是引起成人原發性腎病綜合征的重要原因，其病理特點為腎小球上皮下免疫復合物的沉積伴基底膜彌漫性增厚[6]，臨床主要表現為大量蛋白尿及血液高凝狀態。MN的發病機制十分復雜，目前對MN發病機制的研究主要以大鼠MN模型為基礎，認為是由于循環抗體與大鼠足突細胞足突表面的megalin以及受體相關蛋白RAP結合后，形成上皮下原位免疫復合物，繼而激活補體，形成C5b-9膜攻擊復合物（MAC），在局部T細胞及細胞因子等的作用下，致使足細胞的損傷、凋亡及脫落以及腎小球濾過膜電荷屏障受損，從而形成大量蛋白尿[7]。

MN的基本病變是腎小球ECM合成與降解失衡所導致的腎小球基底膜ECM的積聚[8]。近年研究證實，腎小球ECM合成與降解的平衡，是決定腎小球ECM積聚和GS的重要環節[9]。體內有多種因子及酶能調節ECM合成及降解，其中纖溶系統在維持血液凝血及纖溶平衡中起重要作用。凝血纖溶系統由PA、纖溶酶原及纖溶酶組成，PAI-1為tPA的快速抑制劑，對維持纖維蛋白溶解系統的穩定性起著決定性作用[10]。國內研究認為MN患者，其機體內的纖溶酶原激活物（PAI）濃度是正常人的6倍，同時纖溶系統活性非常低[11-12]。國外研究證實：在MN患者其腎小球PAI-1 mRNA與t-PA mRNA比率是其他腎小球腎炎患者的六倍之多[13]，本實驗同樣觀察到模型組隨實驗時間延長GBM逐漸增厚，腎組織損害逐漸加重，蛋白尿逐漸增多，腎臟t-PA表達較正常組減少，PAI-1表達較正常組增多，差異均有統計學意義（P<0.05），且隨試驗實驗延長，t-PA呈下降趨勢，PAI-1呈上升趨勢，u-PA于第1 w末出現短暫升高，以后呈下降趨勢，再次證實PAs/PAI-1參與了GBM增厚及尿蛋白產生和發展，局部PAI-1表達增多、PAs表達減少導致的腎組織ECM合成降解失衡，是MN發生發展的重要環節。

正常生理狀態下，腎組織內凝血纖溶處于平衡狀態，當平衡被打破，腎小球ECM的過度沉積則會促進腎小球硬化。本實驗觀察到正常組t-PA/PAI-1比值維持在一個較高水平且恒定，而模型組PAs/PAI-1比值隨時間延長呈逐漸下降趨勢，同樣說明正常情況下，PAs/PAI-1平衡穩定，腎組織ECM合成降解平衡穩定，MN時腎臟局部PAs/PAI-1紊亂，腎小球硬化發生。

綜上所述，在MN的發病過程中，PAs/PAI-1的表達參與了ECM 堆積致GBM增厚的過程、同樣也參與了蛋白尿的產生發展過程。如何上調腎組織PAs、下調PAI-1的表達將成為人類攻克MN的又一治療靶點，同時PAI-1抑制劑的開發及應用將成為防止MN病變進一步發展的又一熱點。在今后的研究中，如何維持PAs/PAI-1平衡穩定，并找到阻斷PAI-1表達的因素，對于抑制腎纖維化的發展，具有極重要的意義。

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編輯/楊倩