梔子對大鼠腸道菌群及血清細胞因子的影響

俞 琦 梁建東 王 平 田維毅貴陽中醫學院基礎醫學院，貴州 貴陽 550025

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實驗研究

梔子對大鼠腸道菌群及血清細胞因子的影響

俞 琦 梁建東 王 平 田維毅*
貴陽中醫學院基礎醫學院，貴州 貴陽 550025

目的：觀察梔子對大鼠腸道菌群和血清細胞因子的影響。方法：將40只大鼠隨機分成正常對照組、抗生素對照組和梔子高/中/低劑量組，抗生素對照組和梔子高、中、低劑量組分別給予鹽酸林可霉素和不同劑量梔子水提物灌胃，正常對照組代以生理鹽水，連續 14d。觀察各組大鼠一般情況，檢測大鼠腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌和腸桿菌菌群數量，及血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、γ-干擾素(IFN-γ)表達水平。結果：與正常對照組比較，抗生素對照組和梔子中、高劑量組大鼠出現腹瀉，體質量明顯下降(P<0.01)；抗生素對照組大鼠腸道內4種菌群數量均發生明顯改變(P<0.05或P<0.01)；梔子中、高劑量組大鼠腸桿菌菌群數明顯降低(P<0.05或P<0.01)，雙歧桿菌、乳酸桿菌和腸球菌菌群無明顯變化；梔子中劑量組大鼠血清TNF-α水平明顯下降(P<0.05)；梔子高劑量組大鼠血清TNF-α和IL-6水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)。結論：梔子對腸道菌群有一定影響，但不引起腸道菌群失調，梔子可下調血清TNF-α和IL-6水平，發揮免疫調節作用。

梔子；大鼠；腸道菌群；細胞因子

中藥梔子(GardeniajasminoidesEllis)是茜草科植物梔子的干燥成熟果實，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒的功效，臨床主要用于急性黃疸型肝炎、膀胱炎、目赤腫痛、上消化道出血等癥[1]。梔子性味苦、寒，歸心、肺、三焦經，為常見的苦寒藥物。歷代醫藥學家認為其苦寒礙胃，有耗氣傷陰之弊。現代研究表明[2]，苦寒中藥可通過干預腸道菌群的種類、數量、比例、定位等生態因素，影響腸道代謝和免疫防御等功能。本研究擬建立不同劑量的梔子水提物灌胃模型，觀察梔子對大鼠腸道中4種優勢菌群和血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、γ-干擾素(IFN-γ)表達的影響，探討苦寒藥梔子對腸道生物學功能的調節作用，為其臨床的合理使用提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 動物 SPF級SD大鼠40只，雌雄各半，體重(200±20)g，購于重慶滕鑫生物技術有限公司，許可證號：SCXK-(軍)2012-0011。

1.2 材料 梔子購于北京同仁堂貴陽藥店，經貴陽中醫學院生藥教研室鑒定為正品。鹽酸林可霉素注射液(河南天方藥業有限公司，批號070120049)，雙歧桿菌BS培養基、MRS培養基、膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂(青島海博生物技術有限公司)，伊紅美藍瓊脂(EMB培養基，杭州微生物試劑有限公司)，大鼠TNF-α、IL-6和IFN-γ ELISA檢測試劑盒(武漢博士德生物有限公司)。

1.3 儀器 SW-CJ-1F超凈工作臺(蘇州凈化)；厭氧培養袋(日本三菱)；371型培養箱(美國Thermo公司)；ELX800全自動酶標儀(美國BioTek公司)；高速低溫離心機 5804D(德國Eppendorf公司)。

2 方法

2.1 中藥水提物的制備 按照規范制劑要求，常規制備梔子水提液，調整濃度相當于生藥2g/mL冷藏備用。

2.2 動物分組及處理 取40只大鼠隨機分成正常對照組、抗生素對照組及梔子高、中、低劑量組，每組8只。梔子水提液以成年人(按60kg計算)常規用藥劑量的等效劑量為中劑量，大劑量為中劑量 5倍，小劑量為中劑量的 1/5。即梔子高、中、低劑量組分別以7.5、1.5、0.3g/kg灌胃給藥，抗生素對照組給予鹽酸林可霉素灌胃[3]，各組給藥體積為2mL/只，正常對照組給予等體積生理鹽水，每日1 次，連續 14d。

2.3 一般情況觀察 觀察和記錄各組大鼠活動、飲食、排便情況，用藥第1天、第7天、第14天稱量各組大鼠體質量，記錄大鼠體質量變化。

2.4 主要菌群分析 末次給藥24h后，大鼠股靜脈取血，4℃靜置過夜，離心取上清，置于-20℃冰箱待測。參照文獻[4]，處死各組大鼠，剪開腹腔，無菌操作取盲腸內容物0.1g，放入無菌試管內，加0.9mL生理鹽水，均勻震蕩15min，將震蕩好的溶液進行10倍系列稀釋至10-9，根據預實驗結果選用合適的稀釋度，分別接種于各種培養基中，雙歧桿菌：BS培養基，37℃厭氧培養72 h；乳桿菌：MRS培養基，37℃厭氧培養48h；腸桿菌：EMB培養基，37℃培養48h；腸球菌：膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂，37℃培養48h。培養結束后計數菌落，根據稀釋度換算每g糞便中的細菌數，結果以菌落形成單位/克(CFU/g)的對數表示，即lg CFU/g。

2.5 血清細胞因子水平檢測 取凍存血清，采用ELISA法，測定TNF-α、IL-6和IFN-γ水平，操作步驟按試劑盒說明書進行。

2.6 統計分析 應用SPSS 19.0軟件進行數據分析，數據以均數±標準差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統計意義。

3 結果

3.1 梔子對大鼠一般情況的影響 正常對照組和梔子低劑量組大鼠進食和飲水量正常，被毛光滑致密，無腹瀉；梔子中劑量組大鼠進食量逐漸下降，活動減少，毛色光澤度降低，出現腹瀉，排稀便?？股貙φ战M和梔子高劑量組大鼠進食飲水明顯減少，腹瀉較重，畏寒倦怠，被毛凌亂無光澤。灌胃后，隨時間延長各組大鼠體質量逐漸上升，但抗生素對照組、梔子高劑量組上升緩慢，且在用藥后期呈現下降趨勢。與正常對照組比較，用藥第7 天，抗生素對照組和梔子高劑量組大鼠體質量顯著降低(P<0.05)；用藥第14 天，抗生素對照組和梔子中、高劑量組大鼠體質量均明顯下降(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠體質量變化 (x±s,n=8,g)

注：與正常對照組比較,*P<0.05，#P<0.01。

3.2 梔子對大鼠腸道菌群數量的影響 與正常對照組比較，抗生素對照組大鼠腸道內雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌和腸桿菌的數量發生明顯改變(P<0.05或P<0.01)；梔子低劑量對大鼠腸道中以上4種菌群無明顯影響；在梔子中、高劑量干預下，大鼠腸桿菌菌群數顯著降低(P<0.05或P<0.01)，雙歧桿菌、乳酸桿菌和腸球菌菌群無明顯變化。見表2。

表2 梔子對大鼠腸道菌群的影響 (x±s,n=8,lgCFU/g)

注：與正常對照組比較，*P<0.05,#P<0.01。

3.3 梔子對大鼠血清細胞因子的影響 與正常對照組比較，抗生素對照組大鼠血清內TNF-α、IL-6和IFN-γ均明顯增加(P<0.01)；梔子中劑量組大鼠血清TNF-α水平明顯下降(P<0.05)；梔子高劑量能顯著降低大鼠血清TNF-α和IL-6水平(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 梔子對大鼠血清細胞因子的影響 (x±s,n=8,pg/mL)

注：與對照組比較，*P<0.05,#P<0.01。

4 討論

苦寒藥物是最常用的中藥類別之一，在臨床各科有著廣泛應用?？嗪幋蠖嘤袨a下之功，長期或大量使用容易導致腹部隱痛、腹脹、腹瀉等癥狀。人和動物胃腸道定居著種類復雜和數量龐大的正常微生物群，它們與機體間形成了互利共生的關系，保持相對穩定的狀態，并對機體的物質代謝和免疫防御起著重要作用。包括藥物在內的某些因素導致正常菌群的數量和比例發生大幅度改變時即為菌群失調，常引起急慢性腹瀉和免疫功能紊亂等表現[5]。梔子是臨床常用的苦寒中藥，為了探討梔子對腸道微生態和機體免疫的影響，本研究觀察了口服梔子水提物對大鼠4種優勢腸道菌群和血清細胞因子表達的影響。

結果顯示，梔子中、高劑量可引起大鼠腹瀉、體質量減輕，提示連續服用較大劑量梔子具有明顯的瀉下作用。梔子低劑量對4種腸道優勢菌群無影響，中、高劑量對大鼠腸道內腸桿菌有一定抑制作用，但不影響雙歧桿菌、乳酸桿菌和腸球菌的數量，提示梔子的應用沒有導致大鼠菌群失調，而是起到調節腸道菌群的作用。雙歧桿菌和乳桿菌被認為是腸道的益生菌，可維持腸道的健康環境，并通過競爭性抑制阻礙致病菌的黏附與定植，其產生的有機酸等代謝產物還能抑制或殺死有害生物[6]。梔子保持雙歧桿菌、乳桿菌菌群的相對穩定，提示該藥對腸粘膜可能有重要的保護效應。

TNF-α、IL-6和IFN-γ是由多種免疫細胞分泌的炎性細胞因子，介導機體組織細胞的生長、分化和功能調控，調節機體免疫并引起炎癥反應。羅霞等[7]、孫必強等[8]認為菌群失調與炎癥因子的釋放水平相關。研究顯示，抗生素對照組大鼠血清TNF-α、IL-6和IFN-γ水平均顯著升高，提示菌群失調可能與炎癥反應的發生有關，與文獻研究一致[7-8]。實驗結果顯示，梔子未導致明顯菌群失調，但不同程度地抑制了大鼠血清中TNF-α和IL-6的釋放，提示該藥對機體細胞因子的釋放具有不同程度的調節作用，其調節機制有待進一步研究。

[1]傅春升，婁紅祥，張學順，等.梔子的化學成分與藥理作用[J].國外醫藥·植物藥分冊，2004，19(4)：152.

[2] 吳云，陳瑞，田維毅.苦寒中藥對腸道菌群結構影響的研究進展[J].中國微生態學雜志，2015，27(2)：235-239.

[3] 于蓮，張靈芝，馬淑霞，等.納米山藥多糖合生元結腸靶向微生態調節劑對菌群失調大鼠細胞因子和凋亡蛋白表達影響[J].中國新藥雜志，2016，25(24)：2871-2875.

[4] 林曦，謝曉煌，吳仕嬌，等.甲嘎松湯對急性肝損傷小鼠腸道菌群及細胞因子的影響[J].中醫藥導報，2016，22(10)：10-17.

[5] 祝司霞.腸道菌群失調與疾病[J].科技信息，2012(25):446.

[6] 王福穎.德氏乳桿菌微膠囊性能評價及對腸道菌群調節作用研究[D].哈爾濱: 黑龍江大學，2014．

[7] 羅霞，羅爽，鄭彥懿，等.腸道菌群失調增加小鼠腸上皮內T淋巴細胞活化和促炎細胞因子分泌[J].細胞與分子免疫學雜志，2016，32(8):1031-1035.

[8]孫必強，周英，劉衛東，等.不同劑型七味白術散對腸道菌群失調小鼠腸黏膜和血清 TNF-α，IL-6的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2016，22(4):95-100.

俞琦(1978-)，女，漢族，博士研究生在讀，副教授，研究方向為中西醫結合基礎。E-mail:sgyq.a@163.com

田維毅(1972-),男，漢族，博士，教授，研究方向為中西醫結合基礎。E-mail:743094997@qq.com

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1007-8517(2017)07-0029-03

2017-01-23 編輯：程鵬飛)