尼莫地平對MCAO/R模型大鼠不同時間點血流灌注量的影響

張枝雪 黃 茜 李 玥 楊志斌 肖 懷 巫秀美 張成桂*1.大理大學昆蟲生物醫藥研究院云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南 大理 671000；2.中國西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發利用2011協同創新中心，云南 大理 671000；3.藥用特種昆蟲開發國家地方聯合工程研究中心，云南 大理 671000

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尼莫地平對MCAO/R模型大鼠不同時間點血流灌注量的影響

張枝雪1,3黃 茜1,3李 玥1,2,3楊志斌1,2,3肖 懷1,2,3巫秀美1,2,3張成桂1,2,3*
1.大理大學昆蟲生物醫藥研究院云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南 大理 671000；2.中國西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發利用2011協同創新中心，云南 大理 671000；3.藥用特種昆蟲開發國家地方聯合工程研究中心，云南 大理 671000

目的：利用激光散斑血流成像技術觀察尼莫地平對大鼠大腦中動脈栓塞模型腦血流灌注量的影響。方法：成年雄性SD大鼠，采用改良線栓法制備大腦中動脈梗塞/再灌注模型。利用激光散斑血流成像技術觀測造模前，缺血再灌注0.5、1、2、24h后腦血流灌注量情況，并對選定區域血流進行分析，再灌注24h TTC染色觀察腦梗死體積。結果：造模成功后大鼠右側腦血流明顯減少，灌胃給4mg/kg尼莫地平后，大鼠局部腦血流漸漸增加，腦梗死面積減少，腦組織含水量減少。結論：尼莫地平能顯著增加MCAO/R模型大鼠血流量。

尼莫地平；腦缺血再灌注損傷；激光散斑血流成像；腦血流量

缺血性腦卒中(Ischemic Stroke，IS)指腦的供血主動脈發生狹窄或阻塞，腦的血液供應出現障礙，導致氧和營養物質的缺乏，從而引起腦的功能異常，腦局部組織壞死[1]。局灶性腦缺血后大腦損傷的進展取決于血流量減少的嚴重程度和缺血后再灌注的動力學變化。提高缺血區域血流量，改善缺血腦組織的血液循環，對于提高患者的治療效率具有重要意義。大腦中動脈栓塞(Middle Cerebralartery Occlusion，MCAO)模型是目前運用最為廣泛的腦缺血模型[2]，但對MCAO模型的血流變化報道不多。尼莫地平對腦缺血引起的神經損傷具有保護作用，能減少缺血腦組織梗死面積，增加局部腦血流量[3]，在臨床前的研究效果顯著，但抗自由基和抗氧化特性在臨床患者中得不到體現。為進一步證實尼莫地平改善腦血液循環的作用，研究引用激光散斑血流成像技術(Laser Speckle Contrast Imaging，LSI)較直觀的、實時的觀察MCAO/R模型后的局部血流變化情況。

1 儀器與材料

1.1 儀器 HWS24電熱恒溫水浴鍋(上海恒恒科技有限公司)；PSI ZR瑞典帕瑞醫學激光散斑血流監測視頻系統(perimed)。

1.2 材料 水合氯醛(批號：20120827，天津市光復精細化工研究所)；硫酸阿托品注射液(批號：03141205，上海禾豐制藥有限公司)；尼莫地平片(批號：BJ29770，拜耳醫藥保健有限公司)；氯化三苯基四氮唑(Triphenyl tetrazolium chloride，TTC，批號：20141119，南京建成生物工程研究所)；2636-100栓線(北京西濃科技有限公司)。

1.3 實驗動物 SPF級成年健康雄性(Sprague-Dawley，SD)大鼠，體量220～250g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SYXK(湘)2011-0003。實驗動物購置后在大理大學實驗動物中心實驗室適應性飼養3～5d后用于正式實驗。飼養條件：清潔級，室溫19～25℃，相對濕度40%～70%，12h明暗交替照明，自由進食、飲水。

2 方法

2.1 腦血流量的測定 大鼠用10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉，肌內注射阿托品0.1mL/100g體重用于抑制呼吸道分泌物。大鼠固定于腦立體定位儀上，用剃毛器剃去大鼠頭部的毛，從頭部正中沿矢狀縫剪開頭皮及筋膜，用手術刀將顱骨表面的骨膜等結締組織清理干凈后，采用785nm波長的半導體激光源均勻照射到頭骨上方約16cm處，設置采樣頻率為8幀/s，曝光時間為10ms，圖像采集像素為1388×1038，連續成像10幀，通過系統將原始的散斑圖像轉換成血流圖和血流信息。在每組實驗中，在大鼠MCAO模型之前記錄一組基線數據，手術后缺血2h，再灌注0.5、1、2、24h各監測一次腦血流并采集血流灌注圖。整個實驗過程中需要檢測肛溫，控制加熱墊溫度，保持大鼠體溫恒定在(37.0±0.2)℃范圍內，實驗中時不時向監測部位滴加生理鹽水，保持表面濕潤。

2.2 大鼠MCAO模型的建立 參考Longa、Kugal等[4-5]方法，并加以改進，采用線栓法復制短暫性大鼠腦中動脈閉塞(MCAO)模型，復制方法如下：將已麻醉的大鼠仰臥固定在手術臺上，用智能恒溫儀使大鼠在手術過程中，肛溫維持在37℃，頸部剃毛并進行常規消毒后頸正中偏左0.5cm處切口約1.5cm，分離右頸總動脈(Common Carotid ar Aery，CCA)至分叉處，分離頸外動脈(External Carotid Artery，ECA)和頸內動脈(Internal Carotid Artery，ICA)。結扎CCA近心端，用一個微動脈夾夾閉CCA遠心端，在CCA上用縫合線扎一活結，眼科剪在距離分叉約1cm處剪一“V”形缺口，將線栓經缺口插入，松開CCA上動脈夾，調整線栓進入角度(向左側傾斜約20°角)，使線栓進入ICA再次調整進線角度(向右側傾斜約15°角)并輕輕拉CCA，使栓線進入大腦，微遇阻力時停止，此時線栓插入深度為18～20mm (ECA與ICA分叉處為起點)，線栓頭端通過MCA起始處，到達較細的大腦前動脈。仔細關閉創口，縫合皮膚，此時完成大鼠MCAO模型的制備。

2.3 TTC染色及梗死體積計算 大鼠腦缺血再灌注24h斷頭處死取腦，去除嗅球及小腦，濾紙吸去腦表面水分，稱濕重后，立即放入-20℃冰凍15min后取出，由前向后做連續冠狀切片，共5片。將腦切片置于pH7.4，0.01mmol/L PBS配制的0.2% TTC溶液中，37℃避光孵育30min，期間不時搖晃燒杯，使腦切片與TTC溶液充分接觸。數碼相機拍照，計算腦梗死率。

2.4 腦組織含水量 TTC染色后將5片腦組織置于110℃烘箱中烘烤24h，在干燥器中冷卻至室溫后稱干重。計算腦組織含水量=(腦組織濕重-腦組織干重)/腦組織濕重×100%。

2.5 大鼠神經病學評分 大鼠缺血2h，再灌注6h和24h進行神經功能缺損評分。參照Longa[4]并加以改進的5分制法進行評分，0分：無神經功能缺損癥狀；1分：輕度缺損，即提尾懸空不能伸展左側前爪；2分：中度缺損，即行走向左側轉圈；3分：中度缺損，即行走困難，并向左側傾倒；4分：重度缺損，不能自發行走，意識水平下降。

2.6 數據處理 對于每組記錄的10幀散斑圖像數據，選取每組中間的8幀進行分析；數據采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，以Mean±S表示，數據符合正態性且方差齊的，采用參數檢驗中的單因素方差分析(one-way ANOVA)比較，組間兩兩比較采用LSD(最小顯著差檢驗)，數據不符合正態性或方差不齊的采用非參數檢驗中的Mann-Whitney檢驗分析比較，以P<0.05表示差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 形態學觀察 假手術組造模前后腦左右測紅色區域變化不大，說明血流量無明顯變化。模型組造模前后右側腦可明顯發生變化，造模后再灌注0.5h右側腦紅色區域明顯減少，到24h時黃色區域面積相對于2h時明顯增多，說明隨時間延長模型越嚴重。尼莫地平組再灌注0h時開始灌胃給藥，再灌注0.5h時明顯看到右側區域血流變化，24h時缺血側(黃色區)面積相對于0.5h、1h和2h明顯減少，說明尼莫地平能增加腦血流量。見圖1。

3.2 不同時間點血流量 在缺血側同一區域畫相同大小的面積，如圖1。計算所畫區域的腦血流量。見表1。MCAO/R模型前，所有大鼠腦血流量差異無統計學意義(P>0.05)。假手術組造模前后腦血流變化不明顯；與假手術組比較，模型組缺血2h，再灌注0.5、1、2、24h不同時間點腦血流呈現下降的顯著下降，且24h腦血流量較前幾個時間點血流量低，說明模型組腦組織隨著時間的延長損傷越嚴重(由299.18±49.44下降到175.42±41.64)；尼莫地平組缺血2h，再灌注后腦血流呈現先下降后上升的趨勢，與模型組比較，在缺血2h再灌注24h時，其腦血流量顯著上升，提示尼莫地平對腦組織可能具有保護作用。

表1 尼莫地平對腦缺血再灌注損傷模型后大鼠不同再灌注時間點腦血流量的影響 (x±s)

注：與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，▲▲P<0.01。

3.3 大鼠腦組織TTC染色 TTC染色后，正常組織染成紅色，腦缺血組織成白色。假手術組大鼠左右腦半球無梗死，模型組大鼠右側出現大面積梗死，尼莫地平組大鼠梗死面積減少。見圖2。

3.4 大鼠腦梗死率及腦組織含水量的影響 MCAO模型組相對于假手術組腦梗死率顯著及腦組織含水量顯著增加，差異具有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，尼莫地平組的梗死率和腦組織含水量都顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.01)。

表2 尼莫地平對腦缺血再灌注損傷模型后大鼠腦組織含水量的影響 (分，x±s)

注：與模型組比較,**P<0.01。

3.5 尼莫地平對MCAO模型神經功能的影響 6h時，與假手術組比較，模型組神經功能評分顯著增大，差異具有統計學意義(P<0.01)，提示造模成功；與模型組比較，尼莫地平組評分顯著降低差異有統計學意義(P<0.01)。橫向比較，與6h時比較，24h時模型組評分明顯增加，而尼莫地平組明顯降低。提示尼莫地平可減輕MCAO模型大鼠神經功能評分。

表3 尼莫地平對腦缺血再灌注損傷模型后大鼠神經功能的影響 (分，x±s)

注：與模型組比較，**P<0.01。

4 討論

腦缺血的動物模型雖然種類繁多，但都無法同時滿足以下三個模擬臨床的基本要求：創傷小、局部缺血、可再灌注。直到MCAO/R模型的出現，才出現了一個真正受廣泛認可模擬臨床中風的模型。MCAO模型是一種被廣泛運用的腦缺血模型[2]，但其也存在一定的局限性，如大鼠血管的差異導致模型的不穩定性等。在做 MCAO模型時利用激光散斑技術進行實驗進行血流監測，實時監測血流情況能幫助較快發現造模失敗和極端變異個體，提高實驗效率，有助于控制實驗質量。文獻[6]所述，把MCAO前的腦血流定義為100%，缺血時局部腦血流降到25%以下，說明模型成功，繼續進行下面的實驗，否則剔除。當腦血流因各種原因下降時，就會導致腦的病理性改變，造成缺血性的腦損傷，此時，缺血區血流大幅減少，ATP迅速耗竭，缺血區域的中心組織細胞開始死亡[7]。因此，研究腦血流量變化不僅有助于研究疾病發生的病因病機，還可以作為一項指標進行藥物的篩選。研究中，尼莫地平能夠改善多個與腦缺血損傷有關的病理機制，如抑制血小板聚集，提高腦組織清除自由基的能力，拮抗5-HT，TXA2和前列腺素F2α(PGF2α)等多種血管活性物質引起的血管收縮[8]。尼莫地平不僅能舒張血管平滑肌，預防和解除腦血管痙攣，改善腦部微循環，亦能保護腦缺血時由于鈣離子內流超載所致的腦細胞損害，對腦缺血引起的神經細胞損傷具有重要的保護作用[9]。評價梗死主要有兩種方法，一種是使用HE染色法，另一種是TTC染色法，HE染色法的原理為缺血區細胞死亡，細胞核無法著色，染色顯示為蒼白。TTC染色的原理為TTC與細胞線粒體脫氫酶結合，線粒體失活便無法著色，染色顯示為蒼白，TTC染色方法比較簡便快捷，是目前評價梗死的最主要方法。實驗研究表明在栓塞大腦中動脈15min后，整腦冠狀切面用TTC染色，就可出現肉眼可見的缺血灶，主要位于缺血半球側邊部分的大腦尾殼核區；栓塞2～3h后缺血灶的面積趨于一致；在視交叉前后約2～3mm范圍內作冠狀切面，缺血灶約占同側腦冠狀切面面積的60%～85%，缺血灶累及的結構有：大腦背外側的皮質層、尾殼核、丘腦外側部下丘腦的背外側部[10]。結果顯示，尼莫地平能明顯降低皮層區的梗死灶，有助于大鼠腦缺血再灌注后腦組織損傷區半暗帶的恢復，抑制腦梗死范圍的進一步擴大。

腦水腫是缺血性腦血管病主要的臨床并發癥之一，在大鼠MCAO/R模型中主要存在細胞毒性腦水腫和血管源性腦水腫，兩種水腫類型的機理依據出現時間不同，前者為在缺血時便出現并持續整個缺血再灌注過程，后者只在再灌注過程中出現，在再灌注過程中兩者常同時存在。腦水腫與其引起的顱內壓增高是腦梗死早期致死主要原因，而且腦水腫會引起腦血流進一步下降，加重腦缺血損傷。結果顯示，尼莫地平組降低大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織內水分含量，能在一定程度上減輕腦缺血再灌注損傷。

綜上，研究采用激光散斑成像技術測定尼莫地平對腦缺血再灌注損傷大鼠腦血流量的影響，并對選定區域血流進行分析，TTC染色觀察腦梗死體積及腦組織含水量，初步闡明尼莫地平能增加腦血流灌注量，從而改善腦供血，對腦組織有保護作用。

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Effect of Nimodipine on MCAO/R Rats Different Time Point Blood Perfusion

ZHANG Zhixue1,3HUANG Xi1,3LI Yue1,2,3YANG Zhibin1,2,3XIAO Huai1,2,3WU Xiumei1,2,3ZHANG Chenggui1,2,3*

1.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D, Institute of Entomoceutics Research, Dali University, Dali 671000, China;2.Yunnan Provincial 2011 Collaborative Innovation Center for Entomoceutics, Dali University,Dali 671000, China;3.National-Local Joint Engineering Research Center of Entomoceutics,Dali 671000, China

Objective To study the effect of nimodipine on cerebral blood flow in MCAO/R rats by laser speckle imaging (LSI). Methods To establish the MCAO/R model in male SD rats by the modified intraluminal filament technique. Measuring the cerebral blood flow before modeling and after ischemia-reperfusion for 0.5 h, 1 h, 2 h, 24 h by LSI, meanwhile analysing the selected area blood flow, and observing the infarct size after perfusion for 24 h with TTC. Results The cerebral blood flow was decreased in right hemisphere after the models established successfully, and after the intragastric administration of nimodipine with 4 mg/kg, the regional cerebral blood flow of rats gradually increased, the cerebral infarction area reduced, and the brain water content was decreases. Conslusions Nimodipine significantly improve the cerebral blood flow of MCAO/R rats.

Nimodipine; Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury; Laser Speckle Imaging; Cerebral Blood Flow

云南省應用基礎研究計劃重點項目(2014FA007)；國家自然科學基金(81260475、81360679)。

張枝雪(1989-)，女，漢族，碩士研究生在讀，研究方向為昆蟲藥物經皮給藥治療腦血管疾病。E-mail：dlzhangzhixue@163.com

張成桂(1978-)，男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向為天然藥物研究與開發。E-mail：chengguizcg@163.com

R965

A

1007-8517(2017)07-0042-04

2017-02-11 編輯：程鵬飛)