多菌種發酵生產微生物蛋白飼料的菌種篩選研究

李洋++李忠軍

摘要 對茶粕固態發酵生產微生物蛋白飼料的菌種進行篩選試驗。結果表明：茶粕接入霉菌和酵母菌組成的混合菌種進行發酵可獲得較多的菌體干重，其中尤以黑曲霉、米曲霉、綠色木霉和產朊假絲酵母組成的混合菌種發酵茶粕獲得的菌體干重最多，可達到20.55 g/L左右。因此，選用這4種菌種作為茶粕發酵生產微生物蛋白飼料的最優混合菌種。

關鍵詞 茶粕；微生物蛋白飼料；固態發酵；霉菌；酵母菌

中圖分類號 S816.4 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）05-0228-03

Abstract An research for producing microbial protein feed was conducted by solid state fermentation using oil-tea-cake.The dry weight of microbial cells by different mixed fermentations were studied. The results showed that the dry weight of microbial cells in oil-tea-cake by compound culture of microzyme and mildew was more than others.The best compound microbes was screened out，it included Aspergillus niger，Aspergillus oryzae，Trichoderma viride and Geotrichun candidum.When reaction time was 4 days，the dry weight of microbial cells in oil-tea-cake by the four microbes increased to 20.55 g/L.So the four microbes could be selected as the optimum compound microbes on producing microbial protein feed with oil-tea-cake.

Key words oil-tea-cake；microbial protein feed；solid fermentation；mildew；microzyme

我國是世界上油茶品種最多、分布最廣、籽產量最高的國家，油茶籽、茶粕（即油茶籽榨油后剩下的渣）年產量分別為100萬、73萬t左右[1]。在我國江西、湖南等南方丘陵地區，油茶是一種重要的油料植物。

目前，我國茶粕大部分被用作清塘劑、肥料、燃料，甚至廢棄，僅少量用于茶皂素的提取，造成了資源浪費，同時也污染了環境。茶粕中含有豐富的蛋白質、糖類、粗纖維、灰分和茶皂素，利用價值較高，目前利用茶粕開發飼料的研究受到普遍關注[2-3]。研究表明，茶粕纖維素含量較高，營養水平較低，以及茶粕中茶皂素等抗營養因子含量過高是限制油茶餅粕飼用的主要因素[4-5]。為使茶粕變廢為寶，緩解目前我國蛋白飼料短缺的問題，本試驗以去除茶皂素的油茶餅粕為原料，采用多菌種組成的混合菌種進行發酵，擬篩選出降低茶粕粗纖維含量、提高茶粕飼料適口性、增加茶粕菌體蛋白含量的優良菌種。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種。白地霉、產朊假絲酵母、熱帶假絲酵母、黑曲霉、米曲霉、綠色木霉，均由廣東微生物研究所提供，依次用Y1、Y2、Y3、M1、M2、M3表示。其中，黑曲霉、米曲霉、綠色木霉能產生較豐富的纖維素酶、果膠酶、淀粉酶等酶類，可較好地降解纖維素等多糖并產生較多的還原糖；產朊假絲酵母、白地霉、熱帶假絲酵母則有利用還原糖能快速生長的特點，可較大提高茶粕的菌體蛋白含量。通過不同菌群之間的組合，應當可以實現優勢匹配和“超產”的目標[6-7]。

1.1.2 儀器與設備。超凈工作臺、恒溫培養箱、電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、移液器、電熱恒溫干燥箱、電動離心機、水浴鍋、電爐、試管、量筒、燒杯、三角瓶、容量瓶等。

1.1.3 培養基。①斜面培養基。PDA培養基：用于霉菌培養；麥芽汁瓊脂培養基：用于酵母菌培養。②液體種子培養基。霉菌：葡萄糖2%，可溶性淀粉3.0%，蛋白胨0.15%，KH2PO4 0.3%，（NH4）2SO4 0.5%，MgSO4 0.15%[8-9]，自來水1 000 mL。酵母菌：130 g麥芽汁加水1 000 mL配成12 oBx溶液，供酵母增殖用。

1.2 試驗方法

1.2.1 茶粕固體發酵培養基。茶粕12.5 g，豬血粉2.5 g，（NH4）2SO4 2%，KH2PO4 0.1%，MgSO4 0.05%。

1.2.2 發酵條件。250 mL三角瓶，裝茶粕固體發酵培養基15 g，加自來水20 mL，殺菌后接種經活化及擴大培養的6 種菌種的菌懸液（總接種量為15%，各菌種的接種比均為1∶1），在室溫下培養4 d。

1.2.3 分析測定方法。培養結束后向三角瓶內加入蒸餾水200 mL，30 ℃恒溫水浴浸提3 h，過濾，所得濾液用于測定菌體干重[6-8]。將濾液全部移入離心管中，3 000 r/min離心分離10 min，再分離出上清液，保留管底沉淀物，用蒸餾水洗滌此沉淀物3次[8-9]，收集到的即是微生物細胞。將微生物細胞置于65 ℃烘箱中烘干至恒重，稱重即為菌體干重。

2 結果與分析

2.1 單菌種發酵

用250 mL三角瓶裝茶粕固體發酵培養基15 g，加水20 mL，滅菌后接種單一菌種的菌懸液（接種量均為15%），在室溫下培養4 d。發酵結束后以收集到的菌體干重作為測試指標，試驗結果見圖1。可以看出，采用單一菌種發酵茶粕培養基，收集到的菌體干重很少，最多僅為9.35 g/L，這說明采用單一菌種發酵茶粕時，茶粕和豬血粉中的營養成分很難被利用，因而自身的生長繁殖受到影響[8-10]。為了大量培養菌種細胞，茶粕發酵時應當采用混合菌種進行發酵，有效利用微生物的協同作用，促使各菌種在茶粕基質中都能較好地生長繁殖[11-12]。

2.2 雙菌種發酵

用250 mL三角瓶裝茶粕固體發酵培養基15 g，加水20 mL，滅菌后接種雙菌種的菌懸液（總接種量為15%，2種菌種的接種比為1∶1），在室溫下培養4 d[13-14]。發酵結束后以收集到的菌體干重作為測試指標，試驗結果見圖2。可以看出，采用雙菌種發酵茶粕培養基，發酵后收集到的菌體干重在9.43～13.74 g/L之間，大于單菌種發酵獲得的菌體干重[9]，這是因為霉菌和酵母菌之間存在一種協同作用，霉菌能分泌淀粉酶、纖維素酶及蛋白酶等酶類，降解淀粉、粗纖維及粗蛋白等物質，生成可被酵母菌直接利用的葡萄糖、氨基酸等小分子物質，酵母菌則在這些小分子營養物質的作用下不斷生長繁殖，使發酵后茶粕含有較多的菌體細胞。

2.3 三菌種發酵

用250 mL三角瓶裝茶粕固體發酵培養基15 g，加水20 mL，滅菌后接種三菌種的菌懸液（總接種量為15%，3種菌種的接種比為1∶1∶1），在室溫下培養4 d。發酵結束后以收集到的菌體干重作為測試指標，試驗結果見圖3。可以看出，采用三菌種發酵茶粕培養基，發酵后收集到的菌體干重為10.66～18.91 g/L，差別較大，其中混合菌種M3+Y1+Y2發酵茶粕后收集到的菌體干重可達18.91 g/L，菌體干重居首位，粗纖維含量也降低至10.54%，是三菌種發酵中最優的菌種組合。

2.4 四菌種發酵

用250 mL三角瓶裝茶粕固體發酵培養基15 g，加水20 mL，滅菌后接種四菌種的菌懸液（總接種量為15%，4種菌種的接種比為1∶1∶1∶1），在室溫下培養4 d。發酵結束后以收集到的菌體干重作為測試指標，試驗結果見圖4。可以看出，4種菌種組成的混合菌種能更好地利用培養基中的營養成分來維持各菌種細胞的生長繁殖，四菌種發酵可獲得的菌體干重總體上多于雙菌種發酵及三菌種發酵。

2.5 五菌種發酵

用250 mL三角瓶裝茶粕固體發酵培養基15 g，加水20 mL，滅菌后接種五菌種的菌懸液（總接種量為15%，5種菌種的接種比為1∶1∶1∶1∶1），在室溫下培養4 d。發酵結束后以收集到的菌體干重作為測試指標，試驗結果見圖5。可以看出，采用五菌種發酵茶粕培養基，發酵后收集到的菌體干重要比四菌種發酵低，這說明多菌種發酵時，并非菌種越多越好。因為菌種數增多，會消弱各菌種的優勢，且容易感染雜菌[8-9]，使培養的目的菌種不能較好地生長繁殖，故導致菌體干重減少。

2.6 六菌種發酵

用250 mL三角瓶裝茶粕固體發酵培養基15 g，加水20 mL，殺菌后接種六菌種的菌懸液（總接種量為15%，6種菌種的接種比為1∶1∶1∶1∶1∶1），在室溫下培養4 d。發酵結束后以收集到的菌體干重作為測試指標，復合菌種M1+M2+M3+Y1+Y2+Y3發酵茶粕收獲菌體干重為14.66 g/L。可知6種菌種組成的混合菌種不適宜用來發酵茶粕，這是因為采用六菌種發酵茶粕培養基，發酵后收集到的菌體干重較少，而粗纖維含量也較高[9-10]。

3 結論與討論

本試驗在所選用的菌種范圍內進行了廣泛的篩選，試驗結果表明，茶粕培養基在接入不同混合菌種進行發酵后，都能獲得一定的菌體干重（或菌體蛋白）。但是菌體干重的含量差別較大，在6.57～20.55 g/L范圍內變化，其中3種霉菌和1種酵母菌組成的混合菌種獲得菌體干重最多[8-10，13-14]，尤以混合菌種M1+M2+M3+Y2獲得的菌體干重較多，可達20.55 g/L左右，故該混合菌種是發酵茶粕和血粉生產微生物蛋白飼料的最佳菌種組合。

4 參考文獻

[1] 楊強，胡海波，張石蕊，等.茶粕飼料資源開發及利用技術研究進展[J].飼料工業，2006（1）：53-55.

[2] 楊洪國，李智勇，張德成.我國木本糧油產業發展現狀及對策分析[J].西南農業學報，2010，23（6）：2114-2119.

[3] 周薇，吳雪輝.油茶綜合利用開發前景[J].中國農村科技，2006（10）：21-23.

[4] 王慧杰，李自剛，辛婷，等.多菌種混合發酵玉米秸稈生產含酶蛋白飼料的研究[J].湖南農業科學，2011（7）：125-128.

[5] ROSES R P，GUERRA N P.Optimization of amylase produc-tion by Aspergillums niger in solid-state fermentation us-ing sugarcane bagasse as solid support material[J].World Journal of Microbiology & Biotechnol-ogy，2009，25（11）：1929-1939.

[6] 張偉心，馬艷玲，霍玉鵬.混合菌發酵玉米秸稈生產菌體蛋白飼料的研究[J].飼料研究，2000（6）：5-7.

[7] 郭壯，白梅，張和平，等.利用甜菜糖蜜生產單細胞蛋白的研究[J].糧食與飼料工業，2008（9）：36-38.

[8] 明紅梅，熊俐，曹新志.甘薯淀粉液態發酵生產單細胞蛋白的工藝優化[J].食品與發酵科技，2010，46（3）：68-71.

[9] 鄧桂蘭.混合菌發酵油茶粕生產菌體蛋白飼料的研究[J].糧食與飼料工業，2008（6）：30-32.

[10] 鄧桂蘭.油茶餅粕制備SCP菌種篩選發酵工藝條件研究[J].廣西輕工業，2008（5）：6-7.

[11] 鄧桂蘭.油茶餅粕發酵條件的研究[J].現代食品科技，2008（4）：363-365.

[12] 衛洋洋，蔡海瑩，張放，等.發酵油茶餅粕飼喂荷斯坦牛的試驗研究[J].中國奶牛，2014（1）：8-11.

[13] 衛洋洋.油茶籽粕生物改良及其在奶牛飼養上的應用[D].合肥：安徽農業大學，2013.

[14] 衛洋洋，蔡海瑩，王力生，等.單菌固態發酵油茶餅粕生產多酶生物飼料[J].安徽農業大學學報，2012（1）：41-46.