鐵線蓮屬植物遺傳標記研究進展

和文志+楊玲+王昌命

摘要：指出了鐵線蓮屬植物具有很高的觀賞和藥用價值，在園林綠化中有廣泛地應用。從形態(tài)學標記、細胞學標記及DNA分子標記3個方面總結了鐵線蓮屬植物研究現狀，并且展望了遺傳標記在鐵線蓮屬植物的應用前景。并提出了遺傳標記技術可以應用于鐵線蓮屬植物遺傳變異分析、品種分類及遺傳多樣性評價等的研究。

關鍵詞：鐵線蓮；遺傳標記；研究進展

中圖分類號：S53

文獻標識碼：A 文章編號：1674-9944（2017）6-0191-04

1 引言

鐵線蓮屬（Clematis L.）植物隸屬于毛茛科，有“藤本花卉皇后”的美稱，廣泛分布于世界各地，全世界約有300余種。中國約有該屬植物133種，分布較廣，主要分布在西南地區(qū)[1，2]。該屬植物花期長，花型大且色澤豐富，包含白、粉紅、深藍、紫色等顏色，具有很高的園藝觀賞價值[3]。在歐洲、日本、新西蘭、美國等國家占有十分重要地位，大部分植物園、公園和家庭花園都能見到。此外，鐵線蓮植物因其含有各種藥物活性成分，自中華文明發(fā)源以來就一直做為傳統藥材使用，以根及全株入藥。近年來從各種不同鐵線蓮植物中發(fā)現了三萜皂甙、黃酮、香豆素、生物堿及其他許多活性成分[4～6]，這些活性成分具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗氧化、保肝利膽及抗風濕等作用[7]，鐵線蓮屬植物的藥用價值更是激起了人們對鐵線蓮屬藥用資源植物的研究熱情。

遺傳標記（genetic marker）是指可追蹤染色體，染色體某一些節(jié)段，某個基因座在家系中傳遞的任何一種遺傳特性。生物體任何可遺傳的基因突變導致的表型差異都可以作為遺傳標記。遺傳標記的發(fā)展經歷了形態(tài)學標記（morphological marker）、細胞學標記（cytological marker）、生物化學標記（biochemical marker）及分子標記（molecular marker）4個階段。但是生化標記鐵線蓮屬植物研究中未見報道，其余幾種遺傳標記技術的應用相對比較廣泛。遺傳標記的應用可以為鐵線蓮屬植物的親緣關系分析、遺傳變異及品種分類等研究提供依據。

2 鐵線蓮屬植物的形態(tài)學標記

在鐵線蓮屬植物遺傳多樣性的研究中，形態(tài)學標記是最傳統、最簡便的方法。通過對鐵線蓮屬植物的表現性狀如根、莖、葉、花、果實和種子形態(tài)特征及生理性狀的觀測，可以用于種間分類和親緣關系鑒別等方面的研究。最早由林奈于1753年建立了鐵線蓮屬，并且根據莖形態(tài)特征不同將9種鐵線蓮劃分為攀援類和直立類，還建立了長瓣鐵線蓮屬（Atragene L.）。此后，1818年De Candolle根據總苞、萼片、雄蕊及花柱等形態(tài)特征對鐵線蓮屬分類進行了修訂。1885年Kuntze根據花柱、雄蕊、萼片等花部形態(tài)特征對鐵線蓮屬屬下類群進行分類整理，但其并不承認由De Candolle建立的Naravelia屬。1987年日本學者Tamura根據幼苗葉片、花萼、雄蕊等形態(tài)的描述，將鐵線蓮屬植物劃分為4個亞屬[8]。2000年Grey-Wilson C以花萼水平開展、雄蕊無毛作為原始類群，以花萼鐘狀（或管狀）、雄蕊被毛作為進化類群，將鐵線蓮屬劃分為9個亞屬，這與日本學者Tamura的觀點相反[9]。2000～2006年，王文采[10～15]通過對鐵線蓮屬植物的營養(yǎng)、生殖器官的特征進行描述，根據該屬植物的形態(tài)學特征建立了毛茛科鐵線蓮屬新的分類系統，但該分類系統不贊同前人將Naravelia屬劃分成組的處理。2007年孫誠等[16]通過對全世界約2000份鐵線蓮臘葉標本的形態(tài)學特征調查結果進行系統發(fā)育重建，并且對部分種群進行重新分類，但其研究結果不支持王文采將subsect.Connatae亞組下劃分的一個系ser.Pogonandrae。

形態(tài)學標記不僅用于鐵線蓮屬早期的形態(tài)分類、遺傳進化和親緣關系的研究，而且用于該屬植物的適應性、觀賞性和園藝性狀改良等方面的研究。閆雙喜等[17]闡述了河南境內的鐵線蓮的分布和觀賞特性，對河南鐵線蓮屬植物開發(fā)進行了探討。劉立波等[18]描述了從歐洲引進的6個栽培品種株高、花期、花冠顏色、萼片個數和花徑等性狀，并對其適生性進行評價。蔣京橋等[19]對毛茛鐵線蓮花期、單花的形態(tài)與功能形態(tài)及結實率等生物學特性進行了報道，討論了毛茛鐵線蓮結實率低的原因和解決方法。

3 細胞學標記

細胞學標記是一種把染色體的形態(tài)結構的變異作為遺傳學標記的研究方法。一般是利用核型分析的方法對染色體的數目、形態(tài)進行分析。染色體形態(tài)結構與外部形態(tài)結構相比受外界環(huán)境因素的影響更小。通過對有絲分裂中期的染色體數目、形態(tài)結構的分析從而在細胞學水平上對鐵線蓮進行種屬分類，探討物種的遺傳進化和親緣關系。早在1985年龔維忠等[20]對來自北京和東北地區(qū)鐵線蓮屬的11個種的核型進行了研究，結果表明僅有1種為異源四倍體（2n=4x=32），其余10種為二倍體（2n=2x=16），認為鐵線蓮核型的進化方式分為四種：二倍體到多倍體，最長與最短染色體比值增大，結構變異和由st演化到t型。張鎰鋰[21]對我國鐵線蓮屬的7個種的染色體形態(tài)和數目進行了描述，證明了前人鐵線蓮屬染色體演化趨勢是由對稱到不對稱的研究推論。2011～2015年，盛璐[22，23]先后研究了16種國內野生鐵線蓮和7種購于國外的鐵線蓮的染色體數量和形態(tài)特征。結果表明，鐵線蓮屬染色體數目穩(wěn)定，基數x=8。除圓錐鐵線蓮的染色體為32條外，其余都為16條。核型屬于比較原始的“2A”型。平均臂比值為1.80～3.31之間。連同前人已報道的共計32種鐵線蓮根據核型聚類分析發(fā)現核型分類與形態(tài)學分類結果并不完全一致，作者又從分子水平進行了深入研究。彭綠春等[24]分析了4個野生種和6個國外引進栽培品種鐵線蓮組培幼苗根尖細胞染色體形態(tài)特征。結果表明，除“杰克曼”染色體為14條外，其余染色體數均為16條。根據核型似近系數的聚類分析結果與形態(tài)學分類部分結果是一致的。

4 DNA分子標記

分子標記是繼表型、生理、形態(tài)和生化標記后發(fā)展起來的以核苷酸鏈多態(tài)性為基礎的遺傳標記。分子標記反映了生物個體的可遺傳的核酸序列變異特征，是DNA分子多態(tài)性的直接顯現。與其它遺傳標記相比，DNA分子遺傳標記具有數量豐富，信息量大；取材不受生長發(fā)育的影響；擁有較多共顯性，信息位點完整；基因組中的非編碼區(qū)DNA序列不易受環(huán)境因素影響，而且具有操作簡單、迅速等優(yōu)點。目前在鐵線蓮屬植物研究中運用到的分子標記技術主要一方面基于PCR技術的分子標記：隨機擴增多態(tài)性DNA標記（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD），簡單重復間序列（Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR）分子標記以及聚合酶鏈式反應及單鏈構象多態(tài)性（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP）。另一方面基于DNA序列分析的分子標記：核糖體DNA內轉錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS）序列分析等。

4.1 RAPD分子標記

RAPD分子標記以植物基因組DNA為模板，利用人工合成的隨機引物進行PCR擴增，擴增產物經過瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺就凝膠電泳、染色劑染色之后就可以檢測產物的多態(tài)性[25]。該標記方法廣泛用于物種親緣關系鑒定和遺傳進化的研究。張榮等[26]用RAPD法分析了鐵線蓮屬7種中藥。結果表明RAPD法用于生藥鑒定是可行的。后來普春霞等[27]對云南省具有藥用價值的12種鐵線蓮進行了RAPD分析，利用10個隨機引物對材料DNA擴增得到89條多態(tài)性帶，發(fā)現條帶多態(tài)性百分比100%，不同種擴增出的條帶差異明顯。遺傳聚類分析結果表明RAPD分子標記技術可以用于鐵線蓮屬生藥鑒定，但是利用該標記技術進行系統重建還有待進一步研究。國錦琳等[28]不僅利用RAPD法篩選出5個多態(tài)性好的引物對10種川木通進行擴增，而且在此基礎上構建了特征性序列擴增區(qū)域（sequence characterized amplified region，SCAR）標記，用于川木通藥材鑒定。Yuan等人[29]對從中國各地采集到的Clematis tubulosa，Clematis brevicaudata不同種群及其雜交后代進行RAPD標記和SNP分析后發(fā)現，C. brevicaudata種群遺傳背景一致，而C. tubulosa種群中檢測到較多變異，由這兩個親本（不管是正交還是反交）產生的雜交后代通過RAPD可聚類成為2支，且大多數為源于C. tubulosa的突變植株。

4.2 ISSR-PCR分子標記

ISSR-PCR分子標記技術是以錨定的串聯重復序列為引物進行PCR擴增，對擴增產物進行瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺就凝膠電泳，經過銀染或EB染色后對條帶進行分析[30]。該方法廣泛應用于種質資源和物種親緣關系鑒定以及物種遺傳多樣性研究。孫正海等[31]運用單因子試驗和正交試驗對滑葉藤ISSR-PCR反應體系進行了優(yōu)化，提出了滑葉藤ISSR-PCR的反應中模板DNA、TaqDNA聚合酶、Primer濃度、dNTPs濃度及Mg2+濃度的最佳條件。此外，王楠等[32]采用單因子實驗設計對鐵線蓮園藝品種‘Gravetye Beauty的ISSR-PCR反應體系進行優(yōu)化，并篩選出11條擴增條帶清晰、多態(tài)性好的引物。Cires E等[33]利用ISSR和AFLP對伊比利亞半島西北部瀕危物種R.cabrerensis及其亞種進行研究，分別擴增出2830和103條條帶，發(fā)現多態(tài)性比率分別為97.57%和81.38%。方差分析（AMOVA）結果表明該種的遺傳變異主要來自于不同的地理群體內部，不同地理群體之間的差異達到顯著水平。作者對R.cabrerensis的遺傳結構進行一系列分析，還提出了對該種植物種質資源的保護策略。

4.3 PCR-SSCP標記

PCR-SSCP標記技術是基于單鏈DNA不同構象來檢測基因突變的方法。該方法利用特異引物對基因組DNA進行PCR擴增，擴增產物經過變性劑和高溫處理DNA雙鏈解鏈形成具有某一空間構象的單鏈DNA。經過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染顯色對電泳條帶進行SSCP圖譜分析。根據條帶的不同位置顯示不同個體之間的DNA的特性[34]。該技術廣泛用于基因突變檢測和物種鑒定。安蕊利用PCR-SSCP譜帶分析技術對鐵線蓮屬3種基原植物進行物種分類及鑒別。此外，還通過對比分析威靈仙藥材基原ITS序列，設計出能夠擴增出特異鑒別位點的引物，也正是利用了PCR-SSCP技術的經濟、高通量的特點[35]。

4.4 ITS序列分析

ITS序列片段由于長度相對保守、信息位點豐富且屬、種間差異明顯的特點而多被用于藥材品種鑒定。蔣明等[36]對浙江境內鐵線蓮屬的8種藥用植物進行ITS序列對比。結果顯示了這8種鐵線蓮植物的ITS1和ITS2之間的長度為534～561bp，變異位點及信息位點較為豐富，同時對其遺傳距離和親緣關系進行了分析。李驍等[37]利用PCR法擴增了鐵線蓮屬蒙藥材的rDNA-ITS序列，經過序列的分析比對，從6種藥用植物中ITS序列中，篩選出變異位點57個，特異性鑒別位點33個，證明了ITS序列可以用于鑒別鐵線蓮屬藥用植物。鄭安勇[38]利用PCR技術擴增出18份威靈仙藥材及混偽品的核基因ITS2序列，序列經過測序、拼接及數據分析比對，發(fā)現正品與混偽品的二級結構差異明顯，以核基因ITS2片段為DNA條形碼可以鑒定威靈仙藥材中的混偽品。同樣地，劉美子等[39]利用ITS2片段條形碼也可以鑒別川木通與混偽品及近緣種。由于ITS序列短，提供的性狀數量少，有學者將ITS序列分析與其它分析技術相結合探討鐵線蓮屬植物的遺傳進化關系。如穆琳、謝磊利用槭葉鐵線蓮的ITS和3個葉綠體DNA片段，經目的片段擴增、基因測序之后構建系統發(fā)育樹，結果不支持將槭葉鐵線蓮與繡球藤組聚為一類，認為槭葉鐵線蓮可能是北溫帶古老類群的孑遺[40]。

5 展望

目前，有關鐵線蓮屬植物研究中形態(tài)學標記和細胞學標記的應用較為廣泛，但是形態(tài)學標記是基于個體性狀的描述，易受外部環(huán)境因子的影響，依據形態(tài)進行種群分類產生了很多爭議。而且細胞學標記與傳統的形態(tài)標記在鐵線蓮屬植物遺傳進化關系的研究結果也有許多差異。遺傳標記在本屬植物的研究中，生物化學標記應用未見報道。生物化學標記可以反映同一基因產物蛋白的差異性，不易受環(huán)境因素影響，而且還具有經濟、快速的特點。所以可以加強生物化學標記技術在鐵線蓮屬植物研究中的應用，填補生化標記在鐵線蓮屬應用的空白。此外，雖然DNA分子標記在鐵線蓮屬的研究中已經取得一定的成果，但是已應用到的DNA分子標記技術還較少。鐵線蓮屬植物已有幾百年的栽培歷史。尤其是是在歐洲，育種專家多以雜交育種的方式培育出很多栽培品種，這些栽培品種的遺傳背景十分復雜，品種分類有較多爭議，因此在今后的研究中可以將多種遺傳標記手段相結合，從多方面入手加大鐵線蓮的基礎和應用研究，健全鐵線蓮種質資源的分類和評價體系，對鐵線蓮種質遺傳多樣性的保護、開發(fā)利用及優(yōu)良品種的培育提供參考依據。

參考文獻：

[1]王文采，李良千.鐵線蓮屬一新分類系統[J].植物分類學報，2005，43（5）：431～488.

[2]王文采.云南植物志（14）[M].昆明：云南科學技術出版社，2000.

[3]龍雅宜.新攀援花卉——鐵線蓮簡介[J].園林科技情報，1987，29（5）：8～11.

[4]宋志宏，趙玉英.鐵線蓮屬植物的化學成分及藥理作用研究概況[J].天然產物研究與開發(fā)，1995， 7（2）：66～71.

[5]Hao D C， Gu X J， Xiao P G， et al. Chemical and biological research of Clematis med- icinal resources [J].Chinese Science Bulletin. 2013，58（10）：1120～1129.

[6]Pan L L， Wang X L， Zhang Q Y， et al. Boehmenan， a lignan from the Chinese medicinal plant？Clematis armandii， induces apoptosis in lung cancer cells through modulation of EGF-dependent pathways [J].Phytomedicine， 2016，23（5）：468～476.

[7]Chawla R，Kumar S，Sharma A.The genus Clematis （Raunculaceae）：Chemical and pharmacological perspectives[J]. Journal of Ethnopharmacology，2012，143（1）：116～150.

[8]Tamura M.A classification of genus Clematis[J].Acta Phytotaxonomica et Geobotanica.1987（38）：33～44.

[9]Grey-Wilson C.Clematis the genus[M].Portland，Oregon：Timer Press，2000.

[10]王文采.鐵線蓮屬研究隨記（Ⅰ）[J].植物分類學報，2000，38（4）：305～336.

[11]王文采.鐵線蓮屬研究隨記（Ⅱ）[J].植物分類學報，2000，38（5）：401～429.

[12]王文采.鐵線蓮屬研究隨記（Ⅲ）[J].植物分類學報，2000，38（6）：497～514.

[13]王文采.鐵線蓮屬研究隨記（Ⅳ）[J].植物分類學報，2001，39（1）：1～19.

[14]王文采.鐵線蓮屬研究隨記（Ⅴ）[J].植物分類學報，2001，39（4）：309～336.

[15]王文采.鐵線蓮屬研究隨記（Ⅵ）[J].植物分類學報，2006，44（3）：327～339.

[16]孫 誠，謝 磊，李良千.鐵線蓮屬尾葉鐵線蓮組（毛茛科）基于形態(tài)學證據的分支系統學[J].植物學報，2007，24（1）：87～98.

[17]閆雙喜，王鵬飛，何松林，等.河南鐵線蓮屬植物的觀賞特性及開發(fā)利用[J].河南科學， 2005，23（2）：218～220.

[18]劉立波，楊 慧，王 錦.鐵線蓮屬植物適生性研究[J].北方園藝，2010（1）：144～146.

[19]蔣京橋，牛紅彬，關文靈，等.毛茛鐵線蓮開花結實生物學特性研究[J].中國園藝文摘，2013（1）：13～15.

[20]龔維新，龍雅宜，李懋學.北京地區(qū)鐵線蓮屬植物的核型研究[J].武漢植物學研究，1985，3（4）： 371～379.

[21]張鎰鋰.7種鐵線蓮的染色體研究[J].武漢植物學研究，1991，9（2）：107～111.

[22]盛 璐.鐵線蓮屬16種植物的核型分析[D].南京：南京林業(yè)大學，2011.

[23]盛 璐.鐵線蓮屬植物的核型分析及分子系統學研究[D].南京：南京林業(yè)大學，2015.

[24]彭綠春，于恒雋，余 娜，等.10種鐵線蓮的核型特征及核型似近系數聚類分析[J].湖南農業(yè)大學學報，2012，38（6）：617～622.

[25]Willam J G K，Kubelik A R，Livak K J.DNA polymorphisms amplified by arbitary primers and useful as genetic markers [J].Nucleic Acids Res，1990（18）：6531～6535.

[26]張 榮，邵建本，田學明，等.用RAPD分析法對鐵線蓮屬7種中藥的鑒定研究[J].中草藥，1996，27（11）：686～687.

[27]普春霞，楊竹雅，劉小莉.云南鐵線蓮屬12種藥用植物的RAPD分析[J].云南中醫(yī)學院學報， 2008，31（5）：37～41.

[28]國錦琳，唐 遠，裴 瑾，等.川木通的隨機擴增多態(tài)性DNA與序列特征性擴增區(qū)域標記研究[J].成都醫(yī)學院學報，2011，6（4）：283～286.

[29]Yuan T， Wang LY， ROH M. S. Confirmation of Clematis hybrids using molecular markers[J].Scientia Horticulture，2010，125（2）：136～145.

[30]Zietkiewicz E，Rafaske A，Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR） anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genome，1994（20）：178～183.

[31]孫正海，王 錦，李世峰，等.滑葉藤ISSR-PCR反應體系建立及優(yōu)化[J].云南農業(yè)大學學報，2012，27（5）：746～750.

[32]王 楠，王 錦，李宗艷，等.鐵線蓮園藝品種ISSR-PCR反應體系優(yōu)化與引物篩選[J].北方園藝， 2016（1）：80～83.

[33]Cires E，Cuesta C，Preto J A F.Genetic diversity and structure in fragmented populations of the endangered species Ranunculus cabrerensis （Ranunculaceae）：implication for conservation [J]. Biologia，2013，68（1）：30～40.

[33]閆華超，高 嵐，李桂蘭.分子標記技術的發(fā)展及應用[J].生物學通報，2006，41（2）：17～19.

[34]安 蕊.基于PCR-SSCP和微型條形碼的威靈仙分子鑒定研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學，2013.

[35]安 蕊，陳美蘭，王學勇，等.威靈仙的聚合酶鏈反應-單鏈構象多態(tài)性方法鑒別研究[J].中醫(yī)藥學雜志，2013，48（17）：1247～1249.

[36]蔣 明，周英巧，李嶸嶸.鐵線蓮屬8種藥用植物ITS序列分析[J].中草藥，2011，42（9）：1802～1806.

[37]李 驍，王 佩，趙 龍，等.鐵線蓮屬蒙藥材的rDNA-ITS序列分析[J].內蒙古醫(yī)學院學報，2012，34（4）：325～330.

[38]鄭安勇.以核基因ITS2片段為DNA條形碼鑒定中藥材威靈仙的研究分析[J].中外醫(yī)學研究，2014，12（8）： 155～156.

[39]劉美子，李美妮，姚 輝，等.川木通與其混偽品和近緣種的ITS2條形碼分子鑒定[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2011，（46）：446～450.

[40]穆 琳，謝 磊.槭葉鐵線蓮的系統位置初探-來自ITS和葉綠體DNA序列片段的分析[J].北京林業(yè)大學學報，2011，33（5）：49～55.