黃秋葵多糖的體外抗氧化活性研究

張濤

摘要：以遵義黃秋葵為對象，制備了黃秋葵多糖，研究了其多糖成分的體外抗氧化活性。結果表明：黃秋葵多糖對DPPH、羥基自由基（·OH）和超氧負離子（O-2·）均具有良好的清除作用，與Fe2+有較強的螯合能力，并且黃秋葵多糖的抗氧化作用呈現一定的濃度依賴性。

關鍵詞：黃秋葵；多糖；抗氧化活性

中圖分類號：R285

文獻標識碼：A 文章編號：1674-9944（2017）6-0194-02

1 引言

黃秋葵（Abelmoschus esculentus Moench）屬錦葵科秋葵屬，主要分布于熱帶、亞熱帶及溫帶，在我國貴州、湖北、湖南等地栽培面積較廣，有蔬菜王的稱呼，經濟及食用價值較高[1，2]。現代藥理學研究表明，黃秋葵在養胃、抗疲勞、抗腫瘤、保護心血管及免疫調節等方面具有較好的活性[3～5]。多糖作為植物中的一種重要生物大分子，具有抗氧化、免疫調節、抗腫瘤、抗病毒等多種功能[6～8]，本文聯合利用4種方法對黃秋葵多糖的體外抗氧化作用進行了研究，研究結果將為黃秋葵的綜合開發利用提供理論支撐。

2 材料與方法

2.1 材料和試劑

從市場上采購黃秋葵，烘干至恒重；抗壞血酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉等常規化學試劑購于北京化工廠；辣根過氧化物酶（HRPase）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、氯化硝基四氮唑（NBT）等購于Sigma。

2.2 儀器與設備

可見分光光度計（723型），上海光譜；電子分析天平（SL3001N），上海民橋；冷凍干燥器，北京博醫康；電熱恒溫水浴鍋，北京泰澤瑞達。

2.3 黃秋葵多糖的制備

稱取干燥的黃秋葵500 g，置于裝有8 L蒸餾水的容器中，100 ℃煮提4 h，過濾；重復煮提一次，過濾，合并二次的濾液。于65 ℃將多糖提取液濃縮至約700 mL，4500 r/min離心15 min，收集上清液并加入4倍體積的95%乙醇，靜置過夜。次日，4500 r/min離心15 min，收集沉淀并凍干。將凍干物復溶于700 mL的蒸餾水中，并向該溶液中加入除蛋白試劑（氯仿：正丁醇=4：1）200 mL，劇烈振蕩2 h后，于4500 r/min離心15 min，收集水層，重復2次后，將上清溶液凍干，即得黃秋葵多糖。

2.4 黃秋葵多糖的糖含量、糖醛酸含量及蛋白質含量測定

分別采用苯酚-硫酸法、間羥基聯苯法和考馬斯亮藍法分析多糖中的糖、糖醛酸和蛋白質含量[9]。

2.5 黃秋葵多糖的抗氧化活性測定

2.5.1 對DPPH的清除能力

將黃秋葵多糖溶于蒸餾水中，配成系列濃度的溶液（0.25～4.0 mg/mL）。上述多糖溶液各取4 mL與1 mL DPPH甲醇溶液（0.1 M）混合，混勻并避光反應20 min。以蒸餾水為空白對照，抗壞血酸為陽性對照。DPPH清除率=（1-A黃秋葵多糖/A蒸餾水） × 100%，其中A黃秋葵多糖和A蒸餾水為各溶液在517 nm處的吸光值[10]。

2.5.2 對羥基自由基（·OH）的清除能力

將黃秋葵多糖溶于蒸餾水中，配成系列濃度的溶液（0.25～4.0 mg/mL）。上述多糖溶液各取0.1 mL，與0.4 mL磷酸鹽緩沖液（0.05 M，pH=7.5），乙二胺四乙酸溶液（0.001 M）、H2O2（0.01 M），抗壞血酸溶液（0.002 M），脫氧核糖溶液（0.06 M），FeCl3溶液（0.001 M）各0.1 mL混合，于37 °C孵育1 h。向溶液中繼續加入TFA溶液（10%）和1.0 mL硫代巴比妥酸溶液（1%）各1.0 mL，于100 °C孵育15 min。羥基自由基（·OH）清除率=（1-A黃秋葵多糖/A蒸餾水） × 100%，其中A黃秋葵多糖和A蒸餾水為各溶液在532 nm處的吸光值[11]。

2.5.3 對超氧負離子（O-2·）的清除能力

將黃秋葵多糖溶于蒸餾水中，配成系列濃度的溶液（0.25～4.0 mg/mL）。上述多糖溶液各取1 mL，加入氯化硝基四氮唑（300 μM）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（936 μM）、吩嗪硫酸二甲酯（120 μM）各1 mL混合，于25 ℃孵育5 min。超氧負離子（O-2·）清除率=（1-A黃秋葵多糖/A蒸餾水） × 100%，其中A黃秋葵多糖和A蒸餾水為各溶液在560 nm處的吸光值[12]。

2.5.4 與Fe2+的螯合能力

將黃秋葵多糖溶于蒸餾水中，配成系列濃度的溶液（0.25～4.0 mg/mL）。上述多糖溶液各取1 mL，與0.5 mL FeCl2（2 mM）、0.2 mL菲咯嗪溶液（2 mM）混合，于25 ℃孵育15 min。Fe2+螯合率=（1-A黃秋葵多糖/A蒸餾水） × 100%，其中A黃秋葵多糖/A蒸餾水為各溶液在562 nm處的吸光值[13]。

3 結果分析

3.1 黃秋葵多糖的制備

黃秋葵多糖的制備流程如圖1所示，黃秋葵用8 L蒸餾水在100 ℃下連續煮提二次，過濾，合并二次濾液，濃縮至700 mL，80%乙醇醇沉后靜置過夜，離心后的沉淀經凍干和除蛋白質后，得到淺黃色的黃秋葵多糖37.5 g，收率約7.5%。分析黃秋葵多糖的糖含量約88.6%，糖醛酸含量約19.3%，蛋白質含量約0.9%。

3.2 黃秋葵多糖對DPPH的清除能力

DPPH是一種穩定的有機自由基，可以用來研究多糖對有機自由基的消除活性。黃秋葵多糖對DPPH的清除能力如圖2所示，結果表明其具有較好的DPPH清除活性，且活性隨著多糖濃度的增加而增強，呈現一定的濃度依賴性，EC50約為1.3 mg/mL。

3.3 黃秋葵多糖對羥基自由基（·OH）的清除能力

羥基自由基（·OH）是機體在代謝中產生的自由基，對機體有較大毒性，可以用來研究多糖對自由基的消除活性。黃秋葵多糖對羥基自由基（·OH）清除能力如圖3所示，結果表明其具有一定的·OH清除能力，并且其活性隨著多糖濃度的增加而增強，呈現出一定的濃度依賴性。

3.4 黃秋葵多糖對超氧負離子（O-2·）的清除能力

O-2·作為活性氧其中的一種，可以用來分析多糖對活性氧自由基的清除能力。黃秋葵多糖對超氧負離子（O-2·）的清除能力如圖4所示，其具有一定的O-2·清除能力，并且活性隨著多糖濃度的增加而增強，呈現一定的濃度依賴性，EC50約為3.5 mg/mL。

3.5 黃秋葵多糖與Fe2+的螯合能力

金屬離子（如，二價鐵離子）在機體的脂質氧化過程中有催化作用，通過檢測多糖與金屬的螯合作用，可以間接地反映其抗氧化作用。黃秋葵多糖與Fe2+的螯合能力圖5所示，黃秋葵多糖都具有一定的螯合能力，并且螯合能力隨著多糖濃度的增加而增強，呈現一定的濃度依賴性。

4 結論

本文通過熱水煮提、醇沉、脫蛋白等步驟，制備了黃秋葵多糖，產率為7.5%；并利用4種檢測方法，研究了黃秋葵多糖的抗氧化活性，其均表現出一定的抗氧化活性，且活性隨著多糖的濃度增高而正確，呈現出濃度依賴性。實驗結果將能夠促進黃秋葵相關藥物和功能食品的開發和利用。

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