1株醬香型大曲中高溫放線菌的分離和鑒定

王芙蓉，曾輝，許曌昕，席德州，王歡，曹文濤

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；2.貴州盛世甲秀酒業有限公司，貴州貴陽550025）

1株醬香型大曲中高溫放線菌的分離和鑒定

王芙蓉1，曾輝2，許曌昕1，席德州1，王歡1，曹文濤1

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；2.貴州盛世甲秀酒業有限公司，貴州貴陽550025）

利用GTY培養基自醬香型高溫大曲中分離得到1株放線菌F6，對其進行形態學、生理生化代謝特征鑒定，并結合16S rRNA基因序列分子生物學鑒定及系統發育學分析，結果表明，鑒定F6為高溫放線菌（Thermoactinomycessp）中的普通高溫放線菌（Thermoactinomycesvulgaris）。

醬香型白酒；高溫大曲；高溫放線菌；分離鑒定

醬香型白酒是以高溫大曲為糖化發酵劑，并通過高溫堆積后入窖進行多菌種復合固態純糧發酵而得，期間涉及了多種微生物的參與，這些微生物在白酒釀造階段的含量及發酵產物不同對醬香型白酒的風味都有很大的影響。白酒香味物質的形成更是與高溫大曲中的有益微生物有著緊密的關系。從微生物角度來說，高溫制曲過程中淘汰了大量耐熱性差的微生物，因此高溫培養的過程實際上相當于一個富集嗜熱菌的過程。放線菌是白酒釀造過程中眾多微生物的一種，近年來對它與產香的關系有了較為深入的研究[1-5]。本實驗主要是以醬香型高溫大曲為原料，分離出高溫大曲中的嗜熱放線菌，在前人研究的基礎上對分離到的放線菌進行生理生化檢測和基因測序，為進一步探索該菌與醬香型白酒特殊風味的相關性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：茅臺鎮某酒廠生產的醬香型高溫大曲。

菌株：F6分離自茅臺鎮某酒廠生產的醬香型高溫大曲。

培養基：GTY培養基、ISP2培養基等。

試劑及耗材：TaqDNA聚合酶購自天為時代生物有限公司；Gold View購自北京塞百盛基因技術有限公司；溶菌酶購自Sigma公司，蛋白酶K購自Merk公司，制霉菌素，新制霉素。

主要儀器：超凈工作臺、滅菌鍋、高速冷凍離心機、培養箱等。

1.2 實驗方法

1.2.1 放線菌的分離篩選

1.2.1.1 樣品的預處理

稱取25 g醬香型高溫大曲、5 g CaCO3于500m L的三角瓶中，加入5m L無菌水使其保持濕潤，在28℃的培養箱中培養3 d后，在100℃的烘箱中熱處理1 h，加入225m L的無菌水，在200 r/m in的搖床上振蕩30m in后，在55℃的水浴中保持1 h。

1.2.1.2 抑制劑的選擇

將GTY培養基滅菌后冷卻到50℃，以無菌過濾的方法加入30mg/m L的新制霉素和20mg/m L的制霉菌素。

1.2.1.3 培養

將經過預處理的樣品涂布到GTY培養基上，在55℃下培養48 h[6]。

1.2.2 形態學觀察

將F6菌株接種到ISP2培養基中，采用插片法培養3 d后，再觀察是否形成基內菌絲、氣生菌絲和孢子絲。并在顯微鏡下觀察菌株的氣生菌絲、基內菌絲、孢子絲等生長情況[7]。

1.2.3 溫度敏感性測定

將檢測菌接種在ISP2培養基上，分別置于45℃、50℃、55℃、60℃4個溫度梯度下培養48 h后，觀察其生長狀況。

1.2.4 生理生化特性

生理生化特性鑒定選取明膠液化、淀粉水解、牛奶的凝固與胨化、硝酸鹽還原等項目進行。

1.2.4.1 明膠液化[8]

將菌種接種于明膠培養基中，以55℃培養，分別在3 d、5 d、10 d、20 d和30 d觀察培養基液化程度。在觀察前先將菌種管放入冰箱30m in，如明膠凝成固體狀態，說明不液化，如試管有液體出現，說明明膠已被液化。

1.2.4.2 淀粉水解[8]

將菌種接種在淀粉瓊脂面板上，以55℃培養10 d后，在菌落周圍滴加碘液，如菌落周圍呈現透明圈時，表示菌種產生淀粉酶。若菌落周圍染成藍色，不出現透明圈者，說明該菌株不產生淀粉酶。

1.2.4.3 牛奶的凝固與胨化[8]

將菌種接種在脫脂牛奶管中，以55℃培養，分別在第3天、第6天、第10天、第20天、第30天各觀察1次，如果牛奶形成凝塊，為凝固現象。再繼續培養，如凝塊分解，則為胨化現象。

1.2.4.4 硝酸鹽還原

將菌種接種在硝酸鹽還原培養液中，55℃培養7 d和14 d，分別測定硝酸鹽還原的情況。測定時，倒出培養液1m L于干凈試管中，分別加入硝酸鹽還原試劑甲液和乙液各2滴，如呈紅色反應，即為陽性。

1.2.5 16S rRNA基因序列分析

1.2.5.1 16S rRNA基因PCR擴增和序列測定

利用Ezup柱式細菌基因組DNA提取試劑盒（上海生工）提取菌株基因組DNA，并以基因組DNA為模板，利用通用引物對16S rRNA基因進行PCR擴增，純化后的PCR產物送往上海生工進行基因測序。

1.2.5.2 同源性分析與系統發育分析

登陸NCBI（www.ncbi.nlm.gov/blast/）網站，進行同源性分析，并采用MEGA 5.2將測得序列與GenBank中的模式菌株16S rRNA序列進行分析，構建系統發育樹，獲得目的菌的分類地位或它的系統發育地位。

2 結果與分析

2.1 形態學觀察

放線菌菌株F6在ISP2培養基上55℃插片培養3 d，菌株的形態觀察結果描述見表1，菌落特征和顯微鏡觀察結果見圖1。

表1 放線菌F6的培養特征

2.2 溫度敏感性測定

菌株F6在60℃條件下不生長，在45～55℃溫度范圍內生長，且最適生長溫度為55℃，結果見表2。

2.3 生理生化特征鑒定

菌株F6能夠使牛奶凝固，且胨化；能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，具體結果見表3。

圖1 放線菌的特征

表2 放線菌菌株溫度敏感性特征

表3 菌株F6生理生化結果

圖2 菌株F6的測序結果

2.4 16S rRNA基因系統發育分析

對菌株F6進行了16S rRNA擴增，擴增產物進行了序列測定，測定結果見圖2。菌株的系統發育樹見圖3。可確定F6為普通高溫放線菌（Thermoactinomycesvulgaris）。

3 討論及結論

圖3 菌株F6的系統發育樹

《伯杰氏系統細菌學鑒定手冊》第9版中所描述的放線菌目，能產生單孢子的放線菌歸為4個屬，即高溫放線菌屬、高溫單孢菌屬、糖單孢菌屬和小單孢菌屬[9]。高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）于1899年由Tsilinsky[10]首次描述。它是20世紀前人類所發現的為數不多的幾個放線菌屬之一。該屬的特征是在高溫環境下生長快，在氣絲和基絲上均有單個孢子形成，存在內生孢子，常見于自然界的高溫場所，如堆肥、稻草、蔗渣等。高溫放線菌屬因其能夠形成良好的菌絲體而被歸入放線菌目中，但最近有不少學者對該屬分類地位提出質疑，這不僅是因為其基于16S rDNA序列分析證明該屬的系統進化更接近于芽孢桿菌屬，它們還產生具有類似芽孢桿菌屬的內生孢子，而且它們的G+Cmol%僅為50%左右，遠遠低于其他放線菌屬的65%～75%。根據分子分類研究結果，有學者將該屬并入枯草桿菌菌群。但根據其形態學特征，高溫放線菌屬明顯應歸為放線菌類群。現今，國內外許多有關學者均暫時將其定位在放線菌類群中的未定單元里[11]。高溫放線菌屬從其建立至今已有100多年的歷史，其存在數量多，分布非常廣泛，但到目前為止，僅有為數不多的幾個種被發現并生效描述，這說明發現新的高溫放線菌的潛力還是非常大的。本研究利用細菌通用引物對F6菌16S rRNA基因序列擴增和序列測定，并通過GenBank數據庫進行分析比較和利用MEGA5進行系統進化分析，F6被鑒定為高溫放線菌（Thermoactinomyces sp.）。以基因系統發育分析為基礎，結合生理生化試驗、形態及培養特征結果，并參考Yoon等[12]的相關報道，最終確定放線菌F6為普通高溫放線菌（Thermoactinomyces vulgaris）。該菌從醬香型白酒高溫大曲中被發現并分離得到，本研究尚屬首次。由于高溫放線菌生長發育較快，分泌產生的代謝物種類和性質可能會具有其特殊性，由此可以推測該菌作為優勢菌種在醬香型白酒特殊性風味的形成過程中具有不可忽視的作用。對其進行全面、準確的多相分類學鑒定是研究其在白酒釀造過程中所發揮功能的必要前提。

本研究針對自醬香型白酒高溫大曲中分離得到的嗜熱放線菌F6進行多相分類學鑒定，并最終將F6鑒定為普通高溫放線菌（Thermoactinomyces vulgaris）。該菌株具有特殊的生理生化特征及酶學活性，且是首次從我國醬香型白酒高溫大曲中分離并鑒定得到的高溫放線菌，具有重要的理論研究與實踐應用價值。

[1]CHENM B,YANG D D,QIAN ZW,etal.Analysisof m icroorganismsand physicochem icalproperties in Zaopeiduring the fermentation of Chinese zhijiangflavor liquor[J].African journalof biotechnology,2010, 9(25)：3874-3882.

[2]SHIS,ZHANG L,WU ZY,etal.Analysisof the fungi community inmultiple-and single-grains Zaopei from a Luzhou-flavor liquor distillery inwestern China[J].World journalofmicrobiology and biotechnology,2011,27(8)：1869-1874.

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[7]周德慶.微生物學實驗教程[M].2版.北京：高等教育出版社,2006：56.

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Isolation&Identification of a Thermoactinomyces sp.Strain from High-tem perature Jiangxiang Daqu

WANG Furong1,ZENG Hui2,XU Zhaoxin1,XIDezhou1,WANGHuan1and CAOWentao1
(1.Schoolof Liquor-making&Food Engineering,Guizhou University,Guiyang,Guizhou 550025; 2.Shengshi Jiaxiu Distillery Co.Ltd.,Guiyang,Guizhou 550025,China)

An actinomycetes strain F6 was isolated from high-temperature Jiangxiang Daqu by use of GTY culturemediums.Itsmorphology,physiological features,biological features,andmetabolic featureswere studied.Combined w ith 16S rRNA gene sequencemolecularbiology identification and phylogenetic analysis,strain F6was identified as Thermoactinomycesvulgaris.

Jiangxiang Baijiu;high-temperature Daqu;Thermoactinomyces sp.;isolation&identification

TS262.3；TS261.1；TS261.4

A

1001-9286（2017）04-0042-04

10.13746/j.njkj.2017004

2017-01-09

王芙蓉（1991-），女，在讀碩士研究生，研究方向：釀酒微生物，E-mail：790251343@qq.com。

曹文濤（1967-），男，貴州人，研究生導師，主要從事白酒微生物的研究及其應用，E-mail：cw tgz@163.com。