紫外分光光度法測定辣木酒總黃酮含量

郎定常，盧斌，鄧亞紅，何昆，王用普，何翠容

（四川省酒類科研所，四川成都610017）

紫外分光光度法測定辣木酒總黃酮含量

郎定常，盧斌，鄧亞紅，何昆，王用普，何翠容

（四川省酒類科研所，四川成都610017）

建立紫外分光光度計測定辣木酒中總黃酮含量的方法。酒樣直接與NaNO2、A l(NO3)3、NaOH發生反應，在波長510 nm處測定吸光度值。方法的平均回收率為104.38%，酒樣總黃酮含量測定值的相對標準偏差為1.97%，該方法操作簡便，穩定性好，可運用于辣木酒總黃酮含量的測定。

辣木酒；總黃酮；分光光度法

辣木（Moringa oleifera）來源于印度北部，是一種熱帶多功能植物，生長迅速，營養豐富，被譽為“生命之樹”“植物中的鉆石”，辣木的葉片含礦物質[1]、維生素[2]、氨基酸[3]、黃酮[4]等多種物質，其中黃酮類化合物具有重要的生物活性功能，如抗氧化、抗腫瘤、保護心血管[5]等。為促進四川省白酒產業轉型升級，調整產品結構，四川省酒類科研所與峨眉雪芽酒業有限公司聯合研制開發辣木系列養生酒，黃酮類物質的含量是此產品養生功能的重要指標之一，本文對酒樣總黃酮的測定方法進行深入探討。

目前鮮有關于辣木酒總黃酮測定的相關報道，本實驗以辣木酒為研究對象，確定檢測波長與顯色反應的平衡時間點，研究不同樣品處理方法對測定結果的影響，通過測定回收率驗證方法的準確度，建立辣木酒總黃酮含量的測定方法，為產品質量控制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：酒樣，市售。

儀器設備：INESA 752N紫外分光光度計，0.0001 g電子天平。

5%NaNO2溶液：稱取2.5 g NaNO2（分析純），加適量蒸餾水溶解并定容至50m L，現配現用。

10%Al(NO3)3溶液：稱取5.0 g Al(NO3)3（分析純），加適量蒸餾水溶解并定容至50 m L，現配現用。

4%NaOH溶液：稱取4.0 g NaOH（分析純），加適量蒸餾水溶解并定容至100m L。

256μg/m L蘆丁標準溶液：準確稱取已烘至恒重的蘆丁標準品（中國藥品生物制品檢定所）0.0128 g，加50%乙醇水溶液超聲溶解，轉移至50m L容量瓶，定容到刻度，搖勻備用。

1.2 測定方法

1.2.1 標準曲線

吸取蘆丁標準溶液0.00、2.00 m L、4.00 m L、6.00m L、8.00m L、10.00m L，分別置于50m L容量瓶(蘆丁質量相當于0、512μg、1024μg、1536μg、2048μg、2560μg)，按如下步驟進行顯色反應：加入2.0m L的5%NaNO2溶液,搖勻，放置6 min；加2.0 m L 10%A l(NO3)3溶液，搖勻，放置6 m in；加20.0m L的4%NaOH溶液；加水定容至刻度搖勻，靜置28min后，于波長510 nm處測定紫外吸收值，以吸光度A為縱坐標，樣品質量為橫坐標，得到回歸方程y=0.0002x-0.0002，線性相關系數R2= 0.9997。

1.2.2 樣品測定

量取4.00 m L酒樣作為顯色的反應液。按照1.2.1的方法進行顯色反應，測定得到樣品吸光度值A。

1.2.3 空白試驗

量取4.00m L酒樣置于50m L容量瓶中，按照1.2.1的操作，其中10%Al(NO3)3溶液用蒸餾水代替，測定得到吸光度值A0，以A-A0作為樣品吸光度，從標準曲線上查出或用回歸方程計算出樣品溶液中總黃酮的質量m。

1.2.4 計算公式

式中：m——樣品溶液中總黃酮的質量，μg；v——酒樣體積，m L。

2 結果與討論

2.1 最大吸收波長的選擇

黃酮分子含有鄰二酚羥基，與NaNO2作用生成鄰二醌類物質，在堿性條件下，與A l3+絡合反應生成有色物質，該物質在500 nm處附近具有最大吸收波長。取待測液在480～540 nm隨同空白掃描，結果見圖1，待測液的最大吸收峰出現在510 nm，故選擇510 nm為測試波長。

圖1 最大吸收波長

2.2 顯色反應平衡時間的測定

按照1.2.1的方法處理樣品，記錄隨時間延長紫外吸光度的變化，結果見圖2。反應前28min，樣品吸光度呈不斷下降的趨勢；28～36m in吸光度值趨于一致，36m in之后吸光度開始緩慢降低。反應初期顯色絡合物逐漸形成，吸光度隨之發生變化；反應平衡時絡合物形成，吸光度相對穩定；繼續延長反應時間，絡合物易分解，吸光度發生變化，導致測定結果不準確[6]。本實驗中，顯色反應時間在28～36m in之間達到平衡，這與已經報道的銀杏酒[7]、蓮子酒[8]的平衡時間有差異，可能是辣木酒含有其他物質或黃酮的種類不同等原因造成的。為使反應完全，提高測定效率，縮短測定時間，本試驗樣品選擇放置時間為28m in。

圖2 樣品吸光度隨時間的變化

2.3 蘆丁標準曲線及回歸方程的建立

按照1.2.1的方法，以蘆丁對照液的質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。結果見圖3，得到線性回歸方程y=0.0002x-0.0002,線性相關系數R2=0.9997。該參數大于0.9990，說明此方法測定的吸光度值在標準曲線濃度范圍內與總黃酮的質量成正相關。

圖3 蘆丁標準曲線

2.4 樣品處理

由于黃酮類化合物的醇溶性大于水溶性，故選用甲醇或者乙醇作為提取溶劑；同時辣木酒樣的酒精度為45%vol，據此本實驗選擇如下的樣品處理方式。一是90℃水浴蒸干酒樣，用75%甲醇溶液或者75%乙醇溶液溶解蒸干物，蒸餾水定容后通過顯色反應測定總黃酮的含量；二是酒樣無需處理，利用顯色反應直接測定。每種樣品制備方式測定3個樣，測定結果見表1。

用75%的甲醇或75%的乙醇溶解蒸干物，測定數據的重復性不好，穩定性不高，主要是由于凝固在蒸發皿上的固體物質呈黏稠的膠狀，不易溶解。乙醇溶液對蒸干物的溶解性不如甲醇溶液，延長2種溶液對蒸干樣品的處理時間，總黃酮的測定數值變大；但甲醇具有揮發性和毒性，延長樣品前處理時間，增加操作難度。

表1 不同樣品制備方式對測定結果的影響

樣品直接測定結果的重現性好，操作方便，測定過程中不會涉及有毒試劑，綜上選擇酒樣不經處理，直接測定。

2.5 準確度實驗

為驗證方法的準確度，對辣木酒進行回收率實驗。取辣木酒樣品6份，每2份1組，共3組。分別精確加入蘆丁標準溶液1.00m L、1.26m L、1.51m L，按照1.2.1的方法進行顯色反應，在波長510 nm下測定結果（見表2）。由表2可知，加標樣的平均回收率為104.38%，表明方法的回收率良好，滿足定量分析要求。

2.6 精密度實驗

取同一批次辣木酒酒樣，按照1.2.1的顯色方法測得吸光度值，根據標準曲線計算得到辣木酒總黃酮含量，結果見表3。同一個樣品測定結果RSD為1.97%，表明該方法對測定辣木酒中總黃酮含量的精密度較高，滿足實驗要求。

3 結論

本研究建立辣木酒中總黃酮含量的測定方法，在測定波長為510 nm下，辣木酒樣無需處理，直接進行顯色反應，反應時間在28～36m in之間達到平衡，吸光度值相對穩定。在此條件下測定樣品回收率為104.38%，酒樣中總黃酮測定結果的RSD值為1.97%，測定方法操作簡便，結果可靠，為辣木酒控

表2 辣木酒中總黃酮回收率實驗

制質量提供參考依據，對辣木酒的保健性能指標提供數據支持。

表3 樣品中總黃酮含量測定的結果

[1]任廣旭,伊素芹,張鴻儒,等.辣木功效的研究現狀[J].食品研究與開發,2016,37(16)：228-231.

[2]馬李一,余建興,張重權,等.不同干燥方法對辣木葉營養價值的影響[J].食品科學,2008,29(9)：302-304.

[3]初雅潔,符史關,龔加順.云南不同產地辣木葉成分的分析比較[J].食品科學,2016,37(2)：178-182.

[4]羅曉波,汪開毓,吉莉莉,等.辣木葉的價值及其開發利用研究進展[J].開發與利用,2016,32(11)：84-88.

[5]劉一杰,薛永常.植物黃酮類化合物的研究進展[J].中國生物工程雜志,2016,36(9)：81-86.

[6]蘇銀法.雪蓮酒中總黃酮的含量測定[J].海峽藥學,2002, 14(4)：51-52.

[7]吳婷,張麗.分光光度法測定銀杏酒中總黃酮的含量[J].南京中醫藥大學學報,2005,21(2)：129-130.

[8]吳燦,夏延斌,唐鑫.分光光度法測定蓮子酒中的總黃酮[J].農產品加工(學刊),2013(4)：48-50.

Determ ination of Total FlavonoidsContent in Moringa oleifera Liquor by Spectrophotometry

LANGDingchang,LU Bin,DENGYahong,HEKun,WANGYongpu and HECuirong
(Sichuan Research Institute of A lcoholic Drinks,Chengdu,Sichuan 610017,China)

A method for determ ining flavonoids content in Moringa oleifera liquor by spectrophotometry had been developed.Wine samples directly reacted w ith NaNO2,A l(NO3)3and NaOH,and the absorbance valuewasmeasured atwavelength of 510 nm.The average recovery of suchmethod was104.38%and RSD was1.97%.Suchmethod was simple to operatew ith good stability,and suitable for the determ ination of total flavonoids content in Moringa oleifera liquor.

Moringa oleifera liquor;total flavonoids;spectrophotometry

TS262.91；TS261.7

A

1001-9286（2017）04-0103-03

10.13746/j.njkj.2017009

2017-01-13

郎定常，男，高級工程師，四川省酒類科研所副所長，主要從事酒類研究工作。