糯米蛋白質與黃酒氨基酸的相關性分析

陳金斌，芮鴻飛，方佳寧，吳夢妮，劉興泉，程秀秀

（1.浙江農林大學農業與食品科學學院，浙江杭州311300；2.溫嶺市食品藥品檢驗檢測中心，浙江臺州317500）

糯米蛋白質與黃酒氨基酸的相關性分析

陳金斌1，2，芮鴻飛1，方佳寧1，吳夢妮1，劉興泉1，程秀秀1

（1.浙江農林大學農業與食品科學學院，浙江杭州311300；2.溫嶺市食品藥品檢驗檢測中心，浙江臺州317500）

以36個糯米品種為原料釀造黃酒，通過紅外谷物分析儀測定原料糯米中總蛋白質含量，用考馬斯亮藍G250在595 nm波長下的最大光吸收測定原料糯米中可溶性蛋白質含量，并采用異硫氰酸苯酯(PITC)-柱前衍生高效液相色譜法對黃酒的氨基酸進行定量定性分析，建立糯米蛋白質和黃酒氨基酸的相關性與回歸性分析。結果表明，糯米總蛋白和黃酒游離氨基酸總量的相關系數為0.826，達到極顯著水平；糯米總蛋白質和黃酒單一氨基酸相關系數較好，R=0.931；糯米可溶性蛋白質與黃酒游離氨基酸總量的相關系數為0.303，糯米可溶性蛋白質與單一氨基酸的相關系數為0.704，糯米可溶性蛋白質的相關系數均不如糯米總蛋白質顯著。

糯米；蛋白質；黃酒；氨基酸；相關性

黃酒是我國最具民族特色的酒精飲料，具有悠久的釀造歷史[1]。釀造黃酒以米類為原料，因為大米淀粉含量高，蛋白質、脂肪含量低，能使酒中殘留的界限糊精和低聚糖多，口味也更醇厚。我國多數名優黃酒用糯米釀造，由于糯米中淀粉含量稍高于其他米類，而蛋白質等成分卻相對較低，因此釀成的酒雜味更少，殘留的糊精和低聚糖含量多，口味更加醇厚，深受人們的喜愛[2]。

黃酒中含有豐富的營養，研究發現其含有21種氨基酸，人體自身不能合成必須依靠食物攝取的8種必需氨基酸在黃酒中都具備[3]，因此其也有“液體蛋糕”的美稱。在酒的釀造中，酵母作為菌種在氨基酸的產生過程中起到了重要的作用，而氮源與酵母的生長代謝活動關系密切[4]。葡萄酒[5-6]、啤酒[7-9]及其他發酵酒[10]關于原料蛋白質與酒中氨基酸和香氣等研究較多，而原料糯米營養組成對酒品質影響方面目前研究得還較少。本實驗收集分析了36個糯米樣品中總蛋白質含量和可溶性蛋白質的含量，并且通過分析糯米所釀黃酒中游離氨基酸含量，建立了糯米總蛋白質及可溶性蛋白質與黃酒氨基酸的相關性，為探究原料糯米蛋白質對黃酒氨基酸含量的影響提供了可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品及耗材：36個不同品種的糯稻；17種氨基酸對照品（純度≥98%，sigma公司）；異硫氰酸苯酯（PITC,phenyl-isothiocyanate，純度≥98%，sigma公司）。

儀器設備：丹麥FOSST ECATOR公司生產的XDSContentAnalyzer AD-1100光柵型近紅外光譜分析儀；島津公司高效液相色譜儀（包括LC-20AT二元泵，SPD-M 20A二極管陣列檢測器，CTO-10ASVP自動控溫箱及LC Solution工作站等），日本島津UV-1800紫外可見分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 糯米總蛋白的測定

糯米樣品直接放入近紅外谷物分析儀中掃描獲得光譜，利用MPLS模型和WinISI軟件進行數據統計計算。用近紅外模型分析平均值（ANL%）表示糯米中蛋白質含量[11-13]。

1.2.2 糯米可溶性蛋白質的測定

可溶性蛋白質的測定使用考馬斯亮藍G250（Coomassie brilliant blue G-250）。蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合在595 nm波長下有最大光吸收且與蛋白質含量成正比。考馬斯亮藍G-250法操作簡單快捷，反應迅速靈敏，常作為可溶性蛋白質的測定方法。

1.2.3 釀酒實驗

糯稻脫殼精米后稱取精糯米300 g，加水淘洗干凈無米糠。然后將糯米加水超過米層6～10 cm的高度，用單層紗布遮蓋，室溫下（18℃左右）浸泡2 d。

將浸好的糯米上電熱蒸鍋蒸煮15min，蒸好的糯米飯顆粒完整、外硬內軟、疏松不爛。將蒸好的米飯用自來水冷卻，使淋飯后的糯米飯溫度保持在40℃。取質量為糯米質量0.1%的活性酵母粉加入質量為酵母粉10～30倍的38～40℃水中復水活化30～60m in，依次向酒壇中投入糯米、水、麥曲、液體酵母，攪拌均勻，控制落壇溫度在28～30℃，放置于30℃的恒溫箱中培養發酵。黃酒落壇后按時開耙，發酵4～5 d時封緊壇口，密切關注酒的發酵情況，若溫度過高時，需及時開耙降溫和通風降溫。

1.2.4 黃酒氨基酸的測定

采用異硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生-高效液相色譜法[14-16]對黃酒中的氨基酸進行測定，氨基酸衍生產物在紫外波段254 nm有吸收。用C18色譜柱分離后，紫外檢測器檢測，根據氨基酸標準樣品的保留時間與待測樣品中的組分的保留時間進行定性，外標法定量分析。

色譜分析條件：色譜柱：Inertsil ODS-4 column (3μm，4.6×250mm)；保護柱：InertsilODS-SP(5μm, 4.0×10mm)；進樣體積：10μL；流速：1.0m L/min；柱溫：38℃；檢測波長：254 nm；流動相A液：10mM的磷酸緩沖鹽pH6.2，流動相B液：乙腈；線性梯度洗脫程序為（B液/%）：0～8m in：5%；8～30min：5%～33%；30～35 m in：33%；35.01～40 m in：90%；40.01～55m in：5%；55.01m in：stop。

標準溶液衍生化：準確量取1m L的氨基酸混合對照品溶液，置于刻度試管中，用0.1 mol/L的HCl定容至4m L。取1 m L稀釋后的標準溶液精確加入0.5m L的14%三乙胺的乙腈溶液和0.5m L的1.2%異硫氰酸苯酯的腈溶液搖勻，室溫靜置60m in。反應完全后3000 r/m in離心5min，取上清液加入2m L正己烷萃取，經0.45μm有機濾膜過濾后進樣。

樣品衍生化：取0.25m L離心后的黃酒上清液，加入0.75m L的高純水，精確加入0.5m L的14%三乙胺的乙腈溶液和0.5m L的1.2%異硫氰酸苯酯的乙腈溶液搖勻，室溫下靜置60m in。反應完全后以3000 r/min離心5m in，取上清液加入2m L正己烷萃取，經0.45μm有機濾膜過濾后進樣。

1.2.5 數據分析方法

本文的數據是使用spss17.0數據分析軟件對樣品數據進行相關性分析后得到的。

2 結果與分析

2.1 糯米總蛋白質和可溶性蛋白質含量（表1）

表1 糯米蛋白質檢測結果

采用近紅外光譜分析測定糯米總蛋白含量在8.10%～10.30%之間。其中9號總蛋白含量最高為10.30%，1號、2號、5號、6號、7號、10號、11號、13號、14號、16號、23號、25號、27號、29號、30號、32號、33號、36號18個糯米樣品總蛋白含量在9%～10%之間，其余的17個糯米樣品總蛋白含量在8%～9%之間。可溶性蛋白質含量位于前3位的糯米樣品依次為6號、13號和30號。

2.2 黃酒氨基酸的含量

氨基酸是黃酒的主要成分和營養物質之一，黃酒中氨基酸的種類和含量非常豐富，主要來自原料糯米。原料糯米經過浸泡、蒸煮和發酵之后，大部分蛋白質被微生物發酵利用產生氨基酸，一部分水解成分子量小的肽類物質，剩下的則留在發酵液中[17]。FAO/WHO在1973年提出的理想蛋白質標準是：人體必需氨基酸和總氨基酸含量的比值是40%左右，人體必需氨基酸和非必需氨基酸含量的比值是60%以上[18]。黃酒氨基酸檢測結果見表2，從表2可以看出，黃酒必需氨基酸（essential am ino acid，EAA）和總氨基酸（totalam ino acid，TAA）含量的比值（N/T）為28.7%～36.2%，必需氨基酸和非必需氨基酸（non-essential acid，NEAA）含量比值（N/E）為40.2%～56.7%，黃酒中必需氨基酸和總氨基酸含量的比值以及必需氨基酸和非必需氨基酸含量的比值接近于人體理想蛋白質標準，因此黃酒對人體是比較理想的蛋白質模型，適合人體的生長需要。

黃酒游離氨基酸總量差異明顯，其呈味氨基酸含量由高到低依次為：苦味氨基酸、甜味氨基酸、鮮味氨基酸。根據表2黃酒氨基酸檢測結果可知，36個黃酒樣品中苦味氨基酸的含量為2437 mg/L± 79.4mg/L，甜味氨基酸含量為1191mg/L±41.4mg/L，鮮味氨基酸的含量為203mg/L±8.0mg/L。其中13號、11號、7號氨基酸含量最高，分別為5283.1mg/L、5046.6mg/L、4867.2mg/L。

PITC柱前衍生-高效液相色譜法的氨基酸標準圖譜和黃酒氨基酸圖譜分別見圖1和圖2，黃酒中17種氨基酸的檢測結果見表2。

2.3 糯米總蛋白質與黃酒氨基酸的相關性分析

糯米總蛋白質與黃酒游離氨基酸的相關性分析結果見表3。從表3可以看出，糯米總蛋白質和黃酒游離氨基酸的整體相關系數（Multiple R）非常高，R=0.931。表明以糯米總蛋白質預測黃酒氨基酸的解釋能力為93.1%，調整后的R2也達到了74.1%。這表示17個獨立變量可以解釋糯米總蛋白質為93.1%的變化量，F回歸=6.894＞F0.01(17，18)= 3.21，P＜0.01，模型檢驗的結果指出回歸系數達到顯著水平，該解釋力具有統計學意義。單一氨基酸的Pearson相關性分析中，從呈味氨基酸的分類看，甜味氨基酸Gly與糯米總蛋白的相關性為正相關，達到了顯著水平(p＜0.05),而另外的16種氨基酸與糯米總蛋白的相關性也為正相關，而且達到了極顯著水平(p＜0.01)，說明黃酒單一氨基酸與糯米總蛋白質含量高度相關。系數估計的結果顯示，Lys具有最大的解釋力，Beta達2.294，表示糯米總蛋白質含量越高，黃酒中Lys越多。

圖1 氨基酸標準圖譜

圖2 黃酒氨基酸圖譜

表2 黃酒氨基酸檢測結果(mg/L)

表3 糯米總蛋白質與黃酒游離氨基酸的相關性分析結果

表4 糯米總蛋白質與黃酒游離氨基酸總量的相關性分析結果

由表4糯米總蛋白與黃酒游離氨基酸總量的相關性分析結果可以看出，糯米總蛋白質和黃酒游離氨基酸總量的相關系數（Multiple R）與標準系數（Beta）皆為0.826，這兩個系數的檢驗值相同，F回歸= 72.812＞F0.01(1，34)=7.44，P＜0.01，回歸系數達到極顯著水平，該解釋力具有統計學意義。系數估計的結果表明，糯米總蛋白質含量能夠有效預測黃酒氨基酸含量，Beta系數為0.826，表示糯米總蛋白質含量越高，黃酒氨基酸含量越高。9號樣品糯米總蛋白質含量最高，在所釀造的黃酒中氨基酸總量和各種游離氨基酸的含量也較高。

2.4 糯米可溶性蛋白質與黃酒氨基酸的相關性分析

糯米可溶性蛋白質與黃酒游離氨基酸的相關性分析結果見表5，糯米可溶性蛋白質與黃酒游離氨基酸的整體相關系數為0.704，低于糯米總蛋白質與黃酒氨基酸的相關系數，調整后的相關系數只有0.496，F回歸=1.042＜F0.05(17,18)=3.21，P=0.464，模型檢驗的結果指出回歸系數未達到顯著水平，該相關系數的解釋力沒有統計學意義。單一氨基酸和可溶性蛋白質的相關性分析中，各種氨基酸和可溶性蛋白質的相關系數均不高于0.332，只有Pro的相關系數為0.332，在0.05水平上達到顯著，其他16種氨基酸的相關系數均未達到顯著水平，綜合整體的情況，糯米可溶性蛋白質和黃酒氨基酸的相關性并不明顯。

由表6糯米可溶性蛋白質與黃酒游離氨基酸總量的相關性分析結果可看出，糯米可溶性蛋白質和黃酒游離氨基酸總量的相關系數為0.303，回歸系數的檢驗值也相同，F回歸=3.428＜F0.05(1，34)= 4.13，P=0.073，回歸系數不顯著，該解釋力沒有統計學意義。系數估計的結果不具有統計學意義，Beta系數為0.303。說明糯米可溶解性蛋白質和黃酒氨基酸總量的相關性不明顯。

表5 糯米可溶性蛋白質與黃酒游離氨基酸的相關性分析結果

表6 糯米可溶性蛋白質與黃酒游離氨基酸總量的相關性分析結果

3 結論

糯米總蛋白質與黃酒游離氨基酸的總體相關系數較大，R=0.931，且具有統計學意義；糯米總蛋白質和黃酒游離氨基酸總量的總體回歸系數為0.826，具有統計學意義且相關性達到極顯著水平。糯米總蛋白質與黃酒單一氨基酸的相關性均為正相關，且兩者的相關性都達到了顯著或者極顯著水平。而糯米可溶性蛋白質和黃酒氨基酸之間的相關性不明顯。這說明糯米中蛋白質在很大程度上影響黃酒中游離氨基酸的含量，糯米中總蛋白質含量越高，黃酒游離氨基酸的含量也相對越高。在36個糯米品種中，從糯米總蛋白質含量、黃酒氨基酸含量綜合考慮，9號、11號和13號糯米總蛋白質含量高，釀造的黃酒氨基酸總量也較高，是釀造黃酒的優質糯米原料。

本研究從統計分析的角度研究糯米原料蛋白質對黃酒氨基酸含量的影響，以后將進一步研究糯米營養成分如何轉變為黃酒組成成分的合成機理和轉變路徑。

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Analysisof the Correlationsbetween Am ino Acid Content in Yellow Rice W ine and Protein Content in G lutinousRice

CHENG Jinbin1,2,RUIHongfei1,FANG Jianing1,WUMengni1,LIU Xingquan1and CHENG Xiuxiu1
(1.College of Agriculture and Food Science,Zhejiang Agriculture and Forestry University,Hangzhou,Zhejiang 311300; 2.Wenling Food&Drug Inspection and Testing Center,Taizhou,Zhejiang 317500,China)

Yellow ricew inewas produced by using 36 kinds of glutinous rice respectively under the same conditions.The total protein in glutinous ricewasmeasured by the infrared grain analyzer,the soluble protein content in glutinous ricewasmeasured by Coomassie brilliantblue G250 at595 nm wavelength ofmaximum lightabsorption spectrometry,and qualitative and quantitative analysis of am ino acid content in the produced yellow ricew ine sampleswas performed by using phenylisothiocyanate(PITC)pre-column derivatization HPLC.Finally,amodel for correlation and regression analysis of protein content in glutinous rice and amino acid content in yellow ricew inewas setup.The results showed that,the correlation coefficientbetween total protein in glutinous rice and total free amino acid in yellow ricew inewas 0.826,whichwas of extreme significance;the correlation coefficientbetween totalprotein in glutinous rice and amino acid in yellow ricew inewas 0.931;the correlation coefficientbetween soluble protein content in glutinous rice and total free amino acid in yellow ricew inewas 0.303;and the correlation coefficientbetween soluble protein in glutinous rice and amino acid in yellow ricew inewas0.704.The correlation coefficientof soluble protein in glutinous ricewas inferior to thatof totalprotein in glutinous rice.

glutinous rice;protein;yellow ricew ine;amino acid;correlation

TS262.3；TS261.4；TS261.7

A

1001-9286（2017）04-0051-06

10.13746/j.njkj.2017008

2017-01-10

陳金斌（1983-），男，浙江臺州，本科，工程師，研究方向：食品分析與檢測，E-mail：ruihongfei1991@163.com。

劉興泉（1973-），男，浙江杭州，博士，教授，研究方向：黃酒質量控制與食品安全研究，E-mail：liuxq@zafu.edu.cn。