氟對大鼠支持細胞緊密連接occludin基因與蛋白的影響

張曉燕，張慧慧，程敏，孫子龍，王俊東

（山西農業大學動物科技學院，山西太谷030801）

氟對大鼠支持細胞緊密連接occludin基因與蛋白的影響

張曉燕，張慧慧，程敏，孫子龍，王俊東

（山西農業大學動物科技學院，山西太谷030801）

試驗旨在研究NaF對支持細胞occudin基因和蛋白表達的影響。采用不同濃度的NaF（0，0.1，1，10 mg/L）分別處理大鼠睪丸支持細胞48 h，qRT-PCR檢測occludin基因水平的變化，免疫熒光技術檢測occludin蛋白定位及水平的變化。結果顯示，與對照相比，10 mg/L NaF染毒，occludin mRNA相對表達量顯著下降（P＜0.05）；0.1，1.0 mg/LNaF染毒，occludin mRNA相對表達量下降，但差異不顯著；occludin蛋白隨著染氟劑量的增加，表達量逐漸降低，且occludin蛋白由細胞膜轉移到細胞核附近的部位。說明NaF對支持細胞緊密連接的破壞可能與occudin基因與蛋白表達的變化有關。

氟化鈉；支持細胞；緊密連接；基因；蛋白

全世界大約有15%的家庭存在不孕不育問題，其中由男性因素導致的此問題高達50%[1]。不孕不育癥是繼癌癥和心血管疾病之后出現的新興全球公共衛生疾病，所以，深入研究其原因是非常必要的[2]。眾多學者普遍認為，環境污染是導致生殖功能損害的最重要因素之一，如鎘、雙酚A、全氟辛烷酸、三氧化二砷等[3]。氟是一種非常活潑的鹵族元素，以多種化合物形式存在，廣泛分布于水體、土壤、空氣、食物等環境中[4-5]。氟中毒的癥狀往往表現為氟斑牙、氟骨癥，但隨著研究的深入，現已證實氟對雄性生殖系統也有嚴重的毒性作用[6-7]。睪丸是雄性哺乳動物重要的生殖器官和精子發生場所，其中，血睪屏障（BTB）保證了精子發生的順利進行。BTB是動物睪丸中血管和精細管之間的物理屏障，緊密連接是其主要的組成部分。已有研究表明，動物睪丸中的支持細胞是氟暴露對雄性生殖毒性作用的靶細胞[8-9]。緊密連接存在于相鄰支持細胞基部兩側細胞膜之間，將生精上皮分成基底室和近腔室[10]。occludin蛋白是緊密連接中最重要的蛋白分子之一，與ZO-1等蛋白形成緊密連接的基礎結構。但氟對支持細胞occludin蛋白的影響幾乎未見報道。

本試驗通過統計氟暴露對大鼠睪丸支持細胞緊密連接occludin基因和蛋白表達的影響，探討氟化鈉損傷睪丸支持細胞緊密連接的可能機制。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物出生18～21 d的清潔級SD雄性大鼠，由山西醫科大學實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑DMEM/F12培養基、胎牛血清購于Gibco公司；0.25%胰蛋白酶、IV型膠原酶購于Sigma公司；Trizol，Prime-ScriptTMRT reagent Kit，SYBR@Premix Ex TaqTMII kit購于Takara公司；GATA4抗體購于北京博奧森生物技術有限公司；occludin抗體、FITC標記的山羊抗兔IgG購于武漢三鷹生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 支持細胞的培養20 d左右的SD大鼠頸椎脫臼處死，分離睪丸，去除包膜，在PBS中靜置5min。加入10倍體積的0.1%IV型膠原酶，室溫振蕩7～10min，1000r/min離心5min。棄去上清，加入10倍體積的0.25%胰蛋白酶，室溫振蕩7～10 min，加入DMEM/F12完全培養液（89%DMEM/F12＋10%胎牛血清＋1%青鏈霉素）終止消化，0.074 mm篩網過濾收集懸液，1 000 r/min離心5 min。棄去上清，用PBS洗2次，DMEM/F12完全培養液重懸細胞，鋪板接種，放入37℃，5%CO2培養箱中培養。48h后，棄去培養液，PBS洗2次，用20 mmol/mLpH值7.4的Tris-HCl低滲處理2～5min；然后用DMEM/F12培養液洗2次，加入DMEM/F12完全培養液繼續培養，細胞密度達到80%～90%時，即可進行傳代培養。

1.2.2 支持細胞的鑒定

1.2.2.1 HE染色選擇第2代細胞進行HE染色，棄去培養液，PBS洗3次，95%酒精固定15 min，蒸餾水洗3次，蘇木精染色2～3 min，自來水沖洗直至變藍，伊紅染色30 s，然后用一系列梯度酒精脫水處理，最后經二甲苯透明、明膠封片后，置光學顯微鏡下觀察。

1.2.2.2 GATA4免疫熒光鑒定取出爬片，用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，0.5%Tritonx-100破膜15 min，PBS洗3次，10%的山羊血清封閉30 min，加入兔抗鼠GATA4抗體（體積比為1∶100稀釋），4℃過夜，PBS洗3次，然后加入FITC標記的山羊抗兔IgG，37℃避光孵育60 min，PBS洗3次，加入含DAPI的抗熒光淬滅封片劑，置激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.3 總RNA的提取采用Trizol法提取支持細胞總RNA，具體步驟參照試劑盒說明書。應用Nanodrop ND-1000 spectrophotometer測定總RNA的濃度及A260/A280，A260/A230。

1.2.4 引物設計與合成根據美國國立生物信息技術中心（NCBI）公布的大鼠occludin，GAPDH基因序列，應用Primer 3 Plus軟件設計其引物，所有引物均于上海英濰捷基貿易有限公司合成（表1）。

表1 基因引物序列

1.2.5 qRT-PCR反應體系的建立采取2步法進行qRT-PCR反應。第1步將總RNA反轉錄成cDNA，10 μL反應體系：5 Prime-ScriptTMRT Master Mix 2.0 μL，Total RNA 2.0 μL，RNase Free ddH2O 6.0 μL；反應條件：37℃15 min；85℃5 s。第2步為qRT-PCR反應過程，10 μL反應體系：SYBR PrimixExTaq II（2×）5.0 μL，正、反向引物各0.4 μL，ROXReferenceDyeII（50×）0.2μL，cDNA模板1 μL，RNase Free ddH2O 3.0 μL；反應條件：95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，72℃30 s，共45個循環；95℃1 min，55℃30 s，95℃30 s。采用ΔΔCT法計算目的基因mRNA的表達量。

1.2.6 免疫熒光分析取出爬片，經過4%的多聚甲醛固定，0.5%的Tritonx-100破膜，10%的山羊血清封閉，然后加入兔抗鼠occludin抗體（體積比為1∶50稀釋），4℃過夜，加入FITC標記的山羊抗兔IgG，最后加入抗熒光淬滅封片劑，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.3 圖像分析與數據處理

采用GraphPad Prism5統計分析軟件進行數據分析，結果均用“均值±標準差”表示。差異顯著性利用one-way analysis of variance（ANOVA）方法進行檢驗。*表示P＜0.05差異顯著，**表示P＜0.01差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 支持細胞形態學觀察與鑒定

形態學觀察結果顯示，支持細胞貼壁能力比較強，培養5 h之后開始貼壁，24～48 h之內幾乎完全貼壁，由圓形變為多邊形，培養液中懸浮著一些圓形的生精細胞，48 h后Tris-HCl低滲處理可以將其去除，得到圖1所示結果。細胞折光性降低，呈單層膜狀分布，胞質完全鋪開，間隙縮小，細胞核清晰可見，呈圓形或橢圓形，此時核質比為（7～9）∶1。

HE染色結果如圖2所示，細胞形態不規則，有多個突起，相互連接成網狀，胞質染色淡，胞核染色深，細胞核較大且輪廓清晰。

GATA4鑒定結果如圖3所示，支持細胞幾乎完全被熒光染料著色，驗證了支持細胞是睪丸中唯一高表達GATA4的細胞。

2.2 NaF對緊密連接occludin基因的影響

熒光定量結果顯示（圖4），隨著染毒劑量的增加，occludin mRNA表達量降低，且10 mg/LNaF組與對照組相比差異顯著，而0.1，1.0 mg/LNaF組與對照組相比無顯著性變化。

2.3 NaF對緊密連接occludin蛋白的影響

采用免疫熒光法檢測occludin蛋白在氟中毒的支持細胞中的表達情況。由圖5可知，染氟48 h后，對照組支持細胞occludin蛋白主要在細胞膜上表達，染氟組支持細胞occludin蛋白主要在細胞質靠近核的部位表達；且染氟組支持細胞occludin蛋白與對照組相比表達量降低，尤其10 mg/L染氟組降低明顯。

3 討論

精子的發生是一個復雜的細胞分化過程，它包括3個階段，第1階段是有絲分裂，第2階段是減數分裂，第3階段是精子形成[11]。睪丸支持細胞是曲細精管內唯一與生精細胞直接接觸的體細胞，在生精過程中起支持、免疫屏障等作用[12]。有研究表明，人類支持細胞在含有血清的培養基中，且不添加其他激素和生長因子的條件下能夠恢復增殖能力[13]。本試驗選取的是18～20 d的大鼠，分離得到的支持細胞純度高達98%，此時支持細胞已經分化完全，且停止分裂[12]。試驗分離培養原代大鼠支持細胞運用組合酶消化法和差速貼壁法[14]，剛分離的睪丸支持細胞在倒置相差顯微鏡下呈圓形或橢圓形，貼壁后胞質伸展，伸出偽足，呈不規則狀。

支持細胞的鑒定主要是靠形態觀察、富爾根染色、免疫組化、免疫熒光等。WT1在小鼠的胚胎期青青春期、成年期都有表達，但在睪丸的其他體細胞如間質細胞和外周小管肌樣細胞內，均未見到WT1的表達，表明WT1可以作為支持細胞的特異性蛋白分子[15]。SUN等[8]通過免疫組化的方法利用GATA4蛋白的高表達鑒定睪丸支持細胞。本試驗對培養的支持細胞進行HE染色和GATA4免疫熒光鑒定，結果符合支持細胞的特征，故判定培養的是純度極高的支持細胞。

在曲細精管中，細胞間連接分為緊密連接、橋粒連接、縫隙連接和胞質外特化[2，16]，其中，緊密連接是血睪屏障最主要的組成部分，其主要由2種成分組成：跨膜蛋白和胞質附著蛋白。occludin蛋白是第1個被確定的定位于緊密連接的完整膜蛋白，其基因在進化上非常保守，其中，人、小鼠、狗的該基因有90%的同源性[17]。每一個occludin蛋白分子都有4個跨膜結構域，第1個細胞外環參與了細胞的黏附功能；第2個細胞外環是緊密連接建立和封閉功能所必需的[18]。可見，occludin蛋白是緊密連接功能能夠正常發揮的物質基礎，它在精子發生中及睪丸內緊密連接屏障的形成和維持上具有重要作用。已有研究表明，全氟辛烷、氯化鎘、雙酚A等外源化合物誘導的支持細胞間的緊密連接破壞伴隨著occludin蛋白的表達下降[17，19]，但是氟暴露是否可以導致occludin蛋白的降低還需進行深入探討。

4 結論

本試驗通過對體外培養的支持細胞進行染氟，結果發現，與對照組相比，隨著染氟劑量的增加，occludin基因和蛋白表達量都下降，且occludin蛋白由細胞膜逐漸轉移至靠近細胞核的部位，表明氟暴露影響occludin基因和蛋白的表達。由此推斷，氟暴露破環支持細胞之間的緊密連接，可能是由occludin基因和蛋白表達量的降低與occludin蛋白位置的改變導致的。

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Effect of Fluorine on Sertoli Cell Tight JunctionoccludinGene and Protein in Rat

ZHANGXiaoyan，ZHANGHuihui，CHENGMin，SUNZilong，WANGJundong
（College ofAnimal Science and VeterinaryMedicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

The aim of this study was to figure out the effect of NaF on sertoli cell occludin gene and protein expression.Different concentrations of NaF（0,0.1,1.0,10 mg/L）were used to treat rat testis sertoli cells for 48 h,then detected occludin gene changes by qRT-PCR,the protein changes by immunofluorescence technique.The result showed that the relatire expression of occludin mRNA decreased remarkbly（P＜0.05）,when the cell was treated with 10 mg/LNaF,compared with other groups.When the cell was treated with 0.1,1.0 mg/L NaF,the relative expression of occludin mRNA decreased,but the difference was not significant.And occludin protein expression gradually decreased and transferred from cell membrane to near the nucleus with the increasing dose ofNaF.It illustrates that broken cell tight junction caused byNaF maybe associated with the changes of occludin gene and protein expression.

sodiumfluoride;sertoli cell;tight junction;gene;protein

R114

A

1002-2481（2017）04-0518-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.04.07

2017-01-09

國家自然科學基金項目（31540061）

張曉燕（1990-），女，山西長治人，在讀碩士，研究方向：環境獸醫學。王俊東、孫子龍為通信作者。