氟對大鼠睪丸支持細胞骨架蛋白mRNA的影響

張慧慧，張曉燕，李妍妍，孫子龍，王俊東

（山西農業大學動物科技學院，山西太谷030801）

氟對大鼠睪丸支持細胞骨架蛋白mRNA的影響

張慧慧，張曉燕，李妍妍，孫子龍，王俊東

（山西農業大學動物科技學院，山西太谷030801）

試驗以原代睪丸支持細胞為對象，通過膠原酶和胰酶的消化分離支持細胞，用HE染色及GATA-4免疫熒光對分離的支持細胞進行鑒定；利用qRT-PCR法檢測不同濃度（0，0.1，1，10 mg/L）NaF對支持細胞骨架ARP2，ARPC3和ARPC4處理24 h后mRNA相對表達量，旨在研究氟對雄性生殖功能的影響。結果顯示，ARP2在0.1 mg/L NaF組mRNA相對表達量顯著降低（P＜0.05），在10 mg/L NaF組mRNA相對表達量極顯著降低（P＜0.01）；ARPC4在10 mg/LNaF組mRNA相對表達量顯著降低（P＜0.05）；ARPC3的mRNA表達量沒有顯著變化。表明氟化鈉通過引起支持細胞骨架相關基因相對表達量的下降，影響睪丸支持細胞的結構與功能，進而損傷睪丸的生精功能。

氟化鈉；雄性；生殖功能；支持細胞；骨架基因

氟是動物體內一種微量的必需的安全范圍較窄的元素，其攝入量過多或過少都會引起動物的全身性不良反應。研究表明，環境氟（包括地質性高氟與工業氟污染）不僅影響人類和動物機體的健康，甚至對其生殖功能也會產生較大的毒副作用[1]。氟對雄性動物方面的影響尤為突出，主要表現在精子損傷、精子數量減少和生育力降低[2-3]。

睪丸是一種雄性生殖器官，是生產性毒素主要的靶向器官。已有研究發現，銅中毒對雄性生殖的影響主要體現在對睪丸曲細精管內的各級精元細胞造成破壞，導致精子形態異常，數量減少[4]。支持細胞位于睪丸的精細胞管內，在精子發生期間為生殖細胞提供營養和結構支持[5]。形態學分析表明，睪丸中每個成熟的支持細胞對約30～50個發育的生殖細胞提供結構和營養支持[6]。支持細胞擁有一個組織有序、功能十分活躍的細胞骨架，支持細胞骨架由微絲、微管和中間纖維組成[7]。大量資料表明，生精過程的破壞伴隨著支持細胞骨架結構和功能的變化，ARP2，ARPC3和ARPC4都是屬于ARP2/3復合物的一部分，是細胞骨架組成的關鍵蛋白。ARP2/3復合物是含有ARP2，ARP3和ARPC1-5的7亞基蛋白復合物[8]。氟對雄性生殖器官的研究有很多，但對細胞骨架的研究鮮見報道。

本試驗以大鼠睪丸支持細胞為研究對象，研究氟化鈉對支持細胞骨架蛋白ARP2，ARPC3和ARPC4的mRNA相對表達量的影響，旨在為進一步探討氟對雄性動物生殖功能的損傷機制奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物出生18～21 d的清潔級昆明種雄性大鼠（由山西醫科大學動物實驗中學提供）。

1.1.2 主要試劑氟化鈉（Sigma公司）；DMEM/F12培養基（Gibico公司）；胎牛血清FBS（Gibico公司）；胰蛋白酶（Sigma公司）；青鏈霉素混合液（Hyclone公司）；Ⅳ型膠原酶（Sigma公司）；TritonX-100（Amresco公司）；Trizol Reagent（Invitrogen公司）；Prime-ScriptTM反轉錄試劑盒、SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒（TaKaRa公司）；GATA-4（碧云天）；Goat Anti-Rabbit IgG（博士德生物技術公司）。

1.1.3 主要儀器倒置相差顯微鏡（Leica公司）；Mx3000P實時熒光定量PCR儀（美國Stratagene公司）；D-3752高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；二氧化碳培養箱（ThermoForma公司）。

1.2 方法

1.2.1 支持細胞的原代分離和培養取出生18～21 d雄性大鼠的雙側睪丸，分別用Ⅳ型膠原酶和0.25%的胰蛋白酶對睪丸組織進行消化，待消化完全后，加入等體積的完全培養基終止消化，用0.074 mm篩網過濾收集細胞，離心棄上清，用DMEM/F12完全培養液重懸細胞，鋪板接種，在37℃，5%CO2培養箱中培養。

支持細胞的低滲處理：48 h后，在倒置相差顯微鏡下觀察支持細胞。棄掉培養液，用PBS沖洗2次，加入20 mmol/mL，pH值7.4 Tris-HCl低滲2 min，加入DMEM/F12完全培養液，即可得到純化的支持細胞。

1.2.2 HE染色選用第2代支持細胞進行HE染色，用PBS沖洗貼壁細胞3次，每次5 min，用4%多聚甲醛固定后，依次加入蘇木精、伊紅進行染色，經梯度酒精脫水、透明及封片后，使用電子顯微鏡對試驗結果進行拍照。

1.2.3 GATA-4免疫熒光鑒定選用接種于6孔板的支持細胞，經4%的多聚甲醛固定、0.3%的Tritonx-100破膜、10%的山羊血清室溫封閉后，用抗體稀釋液對一抗進行稀釋（Rabbit Anti-GATA4抗體稀釋比例為1∶100，Rabbit Anti-BRG1抗體稀釋比例為1∶50），用含有FITC的抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 cDNA的合成使用Trizol Reagent RNA試劑盒提取支持細胞各個濃度梯度組的總RNA，用PrimeScriptTM反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，于-80℃冰箱中保存。

1.2.5 引物設計在Genebank中查到相應的RNA序列，利用Premier 3.0軟件設計引物，再將軟件設計的引物放回Genebank中對比，確定不會擴增出其他的序列即可。引物序列列于表1。

表1 實時熒光定量PCR的引物

1.2.6 qRT-PCR的反應體系與反應程序使用SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行qRT-PCR反應，反轉錄出的cDNA按照2×稀釋4個梯度，同時使用不添加模板的空白作陰性對照，反應體系為10 μL：SYBRRPremixExTaqTMⅡ（2×）5 μL，Forward Primer 0.4 μL，Reverse Primer 0.4 μL，ROXRefe-rence DyeⅡ（50×）0.2 μL，cDNA模板2 μL，加已滅菌雙蒸水至10 μL。反應條件：95℃預變性30 s；95℃5 s，60℃30 s，72℃30 s，共45個循環。每個樣本重復3次。

1.3 數據分析

采用GraPHpad Prism 5統計軟件進行數據分析，利用one-way analysis of variance（ANOVA）方法進行數據分析，采用Dunnett's多重比較進行檢驗。*表示P＜0.05差異顯著，**表示P＜0.01差異極顯著，***表示P＜0.001差異非常顯著。

2 結果與分析

2.1 睪丸支持細胞的HE染色

由圖1可知，倒置顯微鏡觀察，支持細胞呈不規則的三角形和星形，胞體有3～4個突起，細胞質完全鋪開，有較大的表面積，染色淡，細胞核多位于基底，呈卵圓形，深染，核的長軸與細胞的長軸方向平行。

2.2 GATA-4免疫組化鑒定結果

通過免疫熒光的方法對GATA-4進行染色，睪丸支持細胞是睪丸中唯一高表達GATA-4的細胞，并可在顯微鏡下觀察（圖2）。

2.3 目的基因mRNA表達的結果

由圖3可知，與對照組相比，ARP2的mRNA相對表達量有所降低，0.1 mg/L NaF組與對照組間差異顯著（P＜0.05），10 mg/LNaF組與對照組間差異極顯著（P＜0.01）；與對照組相比，ARPC4的表達量有所降低，且在10 mg/LNaF組與對照組間差異顯著（P＜0.05）；與對照組相比，不同質量濃度的NaF組ARPC3 mRNA的表達量均無顯著性差異。

3 結論與討論

睪丸支持細胞是處于生精上皮的體細胞，它呈凸起的柱狀，整個細胞由基底膜延伸至管腔內部[9]。各級生精細胞沿著支持細胞，完成自精原細胞至成熟精子所有形態和生理變化[10-11]。支持細胞是環境毒物對雄性生殖器官影響的主要靶細胞[12]。本試驗選擇19～21日齡的雄性大鼠，是因為大鼠隨著青春期的到來，支持細胞喪失了增殖能力，數量達到穩定，而各級的精原細胞的數量相對較少，這個時期培養的細胞純度較高。支持細胞的培養在方法上運用組合酶消化，先將睪丸組織制成單細胞懸液后，利用差速貼壁法來分離純化支持細胞。

支持細胞鑒定的方法有HE染色、吖啶橙熒光染色、富爾根染色、免疫熒光染色等[13-14]。本試驗采用HE染色法進行細胞形態學上的鑒定，支持細胞在倒置顯微鏡下觀察具有典型的形態特征；隨后用支持細胞特異性表達因子GATA-4通過免疫熒光的方法來鑒定。GATA-4是支持細胞中表達的一種轉錄因子，在間質細胞中的表達量很少，在生殖細胞中幾乎不表達[15]。對于雄性生殖系統來說，GATA-4可作為支持細胞的特異性標記分子。

YANG等[16]研究表明，支持細胞的骨架形態和分布發生變化，直接影響著該細胞的結構與功能，進而影響生殖細胞的數量和質量，最終導致精子發生障礙。成熟精子的生成包括精原細胞的增殖、精母細胞的減數分裂和精子細胞成熟[17]。在精子生成過程中，支持細胞為精子的發生提供了結構支撐和發育所需的各種細胞因子[18]。正常情況下，生精細胞的各個發育階段在生精上皮都有特定的位置，而當支持細胞骨架發生紊亂或者破壞時，就會引起精子在曲細精管內的異常分布。支持細胞骨架的功能實現需要精確調節肌動蛋白聚合和解聚所引發的各種微絲的變化，肌動蛋白相關蛋白ARP2/3復合物是本調節的中心參與者[19]。其中，ARP2與ARPC3一起，賦予支鏈肌動蛋白聚合，將“束”肌動蛋白絲改變為分支/去捆綁的網絡，以促進精子形成過程中精子細胞跨精細胞上皮的轉運[20]。ARPC4作為ARP2/3蛋白復合物的7個亞基之一，在控制支持細胞中的肌動蛋白起關鍵作用，是誘導肌動蛋白成核所必需的。本研究結果表明，ARP2，ARPC4的mRNA相對表達量的降低，對細胞骨架的整體結構產生破壞的同時，有可能導致精子細胞在形成過程中的錯誤定位，精子細胞生成減少。

綜述所述，肌動蛋白微絲的破壞會阻礙支持細胞的功能，進而影響正常的生精過程，不過這并不能全面概述細胞骨架對雄性生殖系統研究的具體機制，這一問題需要在今后研究中進一步探討。

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Effects of Fluoride on mRNA Expression of Cytoskeleton Proteins in Rat Sertoli Cells

ZHANGHuihui，ZHANGXiaoyan，LI Yanyan，SUNZilong，WANGJundong
（College ofAnimal Science and VeterinaryMedicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

To explore the effect of fluoride on male reproductive,primary sertoli cells were isolated by means of the enzyme digestion method with trypsin and collagenase.The survival rate and the purity of cells were detected with the HE and the immunohistochemical analysis ofGATA-4.Then the cells were exposed to increasing NaF concentrations（0,0.1,1,10 mg/L）for 24 h. The expression level and distribution ofcytoskeletal gene ARP2,ARPC3 and ARPC4 were detected byquantitative real-time-polymerase chain reaction（qRT-PCR）.The results showed that the relative expression of ARP2 mRNA in 0.1 mg/L NaF group decreased significantly（P＜0.05）,and the relative expression of mRNA in 10 mg/L NaF group significantly decreased（P＜0.01）,the relative expression ofARPC4 mRNA in 10 mg/LNaF group decreased significantly（P＜0.05）.The expression of ARPC3 mRNA did not change significantly.In conclusion,sodium fluoride can decrease the relative expression of cytoskeleton-related genes,affect the structure and function oftesticular support cells,and then damage the testicular spermatogenic function.

NaF;male;reproductive function;sertoli cell;cytoskeletal gene

R114

A

1002-2481（2017）04-0557-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.04.16

2017-01-09

國家自然科學基金項目（31540061）

張慧慧（1991-），女，山西長治人，在讀碩士，研究方向：環境獸醫學。王俊東、孫子龍為通信作者。