黃花菜無菌播種試驗

褚煥寧，侯非凡，賈焱，李芳芳，李曉琳，李森，亢秀萍，邢國明

（山西農業大學園藝學院，山西太谷030801）

黃花菜無菌播種試驗

褚煥寧，侯非凡，賈焱，李芳芳，李曉琳，李森，亢秀萍，邢國明

（山西農業大學園藝學院，山西太谷030801）

黃花菜（Hemerocallis citrina Baroni）兼具食用、觀賞和藥用價值，為了提升雜交育種后代的繁殖速度，試驗以黃花菜種子為材料，經過不同的預處理和消毒處理后接種于MS培養基上進行無菌萌發，培養7 d后統計種子的污染率和發芽率；分不同生理苗齡建立適宜的煉苗體系。結果表明，浸泡24 h后剝去黑色革質外種皮和茸毛狀內種皮，露出白色胚乳的預處理方式種子的污染率最低，為6%，萌發率最高，為80%；70%酒精30 s＋0.1%升汞消毒處理5，10 min，種子的污染率均較低，分別為8%和6%，消毒10 min種子的萌發率低于5 min；植株自然高度在6 cm以上的，移栽20 d后統計的成活率為100%。試驗可為萱草屬植物雜交后代的快速繁殖提供理論基礎。

黃花菜；種子；無菌播種；幼苗；煉苗

黃花菜（Hemerocallis citrina Baroni）為百合科萱草屬宿根草本植物[1]，又叫金針菜、忘憂草，是我國的一種特產蔬菜[2]。全屬約14種，原產于中國、日本、朝鮮等地，其中，原產于我國的有11種，在我國有著悠久的栽培歷史[3-4]。黃花菜資源非常豐富，應用廣泛，觀為花，食為菜，用為藥。因其花型美麗可愛，群體花期長，葉叢優美，既可觀花又可觀葉，又因其對環境條件要求不嚴格，管理粗放，因此，可種植于疏林草地作地被觀賞，種植于庭院、公園作花壇、花境等進行觀賞，還可植于道路兩旁及隔離帶，具有很高的綠化和觀賞價值[5-9]。黃花菜又是我國特產蔬菜，既可鮮食又可制成干菜食用，美味可口[10]。另外，黃花菜中含有豐富的蛋白質、維生素、糖和鈣、磷等礦物質，具有抗衰老、消炎解毒，健腦、安神、明目等功效[11]。

黃花菜的繁殖方式多為分株繁殖。分株繁殖在較短時間內可獲得具有開花能力的植株，并能保持品種特性，但繁殖系數低，易攜帶病蟲草害，種苗成本高等[12]，難以滿足種苗規模化生產的需求。種子繁殖得到的實生苗根系發達，適應環境能力強，但繁殖生產周期長，一般適用于雜交育種[13]。在雜交育種中，由于存在雜交不親和現象，獲得較少的雜交種子時，為提高種子的發芽率，同時加快種子成苗，會借助無菌播種，即將種子消毒處理后接種在培養基上萌發，成苗后煉苗移栽，在短時間內可獲得大量實生苗[14-15]。這是培育黃花菜新品種采用的主要措施。

在前期試驗黃花菜種子穴盤播種育苗的過程中發現，黃花菜種子播種后萌發時間長、萌發率低。本試驗采用無菌播種的方法，研究不同預處理方式和消毒方式對種子萌發時間、發芽率和污染率的影響，以期縮短黃花菜種子的發芽時間，提高種子的發芽率，建立種子的無菌播種體系，從而提高雜交后代的繁殖速度，縮短育種周期[15]，為萱草屬植物雜交后代的快速繁殖提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為山西農業大學黃花菜種質資源圃收集的地方品種茄子花1號（2n＝22）。于2015年9—10月收集種子，并在陰涼通風處晾干。

1.2 方法

選取大小一致飽滿的種子，接種前對種子進行洗滌、蒸餾水浸泡、0.1%高錳酸鉀浸泡、剝皮、熱水浸種預處理；預處理后在超凈工作臺對種子進行表面消毒、浸泡消毒；將已消毒的種子接種到MS培養基上，每個培養瓶接種2粒，每個處理接種25瓶。將接種好的培養瓶置于25℃、相對濕度60%～70%的組織培養室中進行暗培養。種子萌發后進行光培養，光照強度為2 500 lx，每天光照16 h。

無菌播種7 d后統計種子的污染數和萌發數，并記錄進行分析。

1.2.1 傳統催芽播種對黃花菜種子萌發的影響將種子放在培養皿中，上下覆蓋浸濕蒸餾水的紗布，在25℃、相對濕度60%～70%的恒溫培養箱中進行催芽，定期更換蒸餾水，清洗發霉種子，觀察種子萌發情況，將露白種子拿到溫室進行播種，播種基質V草炭∶V珍珠巖＝2∶1。每天觀察記錄種子的萌發情況。

1.2.2 不同預處理方式對黃花菜種子萌發的影響

分別設置不同方式的預處理：A1.洗潔精洗滌，流動自來水沖洗干凈，蒸餾水浸泡種子24 h；A2.洗潔精洗滌，0.1%高錳酸鉀浸泡30 min，蒸餾水浸泡24 h；A3.蒸餾水浸泡24 h后剝去黑色革質外種皮，露出里面茸毛狀內種皮，50℃熱水處理后攪拌冷卻；A4.蒸餾水浸泡24 h后剝去黑色革質外種皮和茸毛狀內種皮，露出白色胚乳，沖洗干凈。

預處理后在超凈工作臺上進行消毒處理，70%酒精30 s＋0.1%HgCl25 min，接種到蔗糖濃度為3%的MS培養基上。

1.2.3 不同消毒方式對黃花菜種子萌發的影響將茄子花1號種子用蒸餾水浸泡24 h后剝去黑色革質外種皮和茸毛狀內種皮，露出白色胚乳，沖洗干凈，在超凈工作臺上進行不同方式的消毒處理：B.70%酒精消毒30 s，2，5 min，分別編碼為B1，B2，B3；C.70%酒精30 s＋6%NaClO消毒3，10，15 min，分別編碼為C1，C2，C3；D.70%酒精30 s＋0.1% HgCl2消毒3，5，10 min，分別編碼為D1，D2，D3。

消毒處理后接種到蔗糖濃度為3%的MS培養基上。

1.2.4 煉苗移栽無菌播種種子萌發后統一煉苗：種子剛露白（E1）；植株自然高度1～3 cm（E2）；植株自然高度4～6 cm（E3）；植株自然高度6 cm以上（E4），將4個生長階段的幼苗種植到溫室進行煉苗處理，基質V草炭∶V珍珠巖＝2∶1，前7 d在陰涼處煉苗，而后逐漸見光。

每7d觀察統計苗子的成活率和生長狀況。長勢程度分為：良好（葉色深綠，葉片挺拔，長勢旺盛）、一般（葉色淺綠，葉片卷曲，長勢較弱）、較差（葉片發黃，葉片萎蔫，長勢很弱）。

茄子花1號種子無菌發芽及煉苗過程如圖1所示。

1.3 數據統計與分析

試驗數據采用SPSS20.0進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 傳統催芽播種對黃花菜種子萌發的影響

茄子花1號種子催芽過程中發現，催芽第5天種子開始露白，第5～12天大部分種子露白，歷時8 d，7個種子發霉腐爛，11個種子到第40天仍無出芽跡象。種子催芽萌發率為64%，播種成苗率為81.25%（表1）。

表1 傳統催芽播種對黃花菜種子萌發的影響

2.2 不同預處理方式對黃花菜種子萌發的影響

本試驗對茄子花1號種子進行了4種不同預處理，結果發現，僅用蒸餾水或高錳酸鉀浸泡，種子污染嚴重，發芽率很低，無法進行種子的繁殖，對種子進行剝皮處理后，污染率極顯著降低，同時剝去內外種皮，萌發率極顯著升高。由表2可知，不對種子進行剝皮預處理，污染率高達90%～96%，萌發率僅為4%～8%；而剝掉外面黑色革質外種皮，污染率極顯著降到10%，萌發率為8%；同時剝掉黑色革質外種皮和茸毛狀內種皮，污染率降為6%，顯著低于只剝掉黑色革質外種皮，發芽率為80%，極顯著高于其他處理。因此，無菌萌發過程中剝去種子內外種皮，可極顯著降低污染率，同時極顯著提高種子的萌發率。

表2 不同預處理方式對黃花菜種子無菌萌發的影響

2.3 不同消毒方式對黃花菜種子萌發的影響

本試驗選用了3種組織培養中常用的消毒劑：70%酒精，5%NaClO，0.1%HgCl2。試驗發現，污染率隨著消毒劑強度的增大而降低，萌發率卻有隨消毒劑強度增大而降低的趨勢。由表3可知，僅用酒精消毒，污染率高達90%以上，萌發率為70%～90%；70%酒精結合5%NaClO消毒，污染率為30%～34%，萌發率為76%～90%，效果略好；70%酒精結合0.1%升汞消毒，效果最好，污染率極顯著降低，僅為6%～12%，萌發率為62%～82%。綜合污染率和萌發率考慮，僅用酒精和酒精結合NaClO消毒處理的萌發率雖較高，但是污染率也很高，不適合對種子進行消毒；酒精結合升汞對種子滅菌10 min，污染率降到了最低，但萌發率也隨之降低，也不適合進行無菌萌發種子的消毒；酒精結合升汞消毒3，5 min，污染率分別為6%和4%，萌發率分別為82%和78%，較適宜進行種子的消毒處理。

表3 不同消毒方式對黃花菜種子無菌萌發的影響

2.4 煉苗移栽

由表4可知，4個不同生長階段的煉苗成活率差異達極顯著水平。其中，剛露白種子（E1）移栽到穴盤里，成苗率最低；植株自然高度為1～3 cm（E2），20 d后成活率為12.5%，長勢較差；植株自然高度為3～6 cm（E3），20 d后成活率為75%，長勢一般；植株自然高度在6 cm以上（E4），20 d后成活率為100%，長勢良好。

表4 煉苗情況

3 結論與討論

茄子花1號種子傳統恒溫培養箱催芽播種過程中，種子集中露白時間為第5～12天，歷時8 d，種子的發芽率為64%，成苗率為81.25%；無菌播種過程中，種子露白時間集中在前7 d，種子發芽率可達到82%且發芽后在培養基生長較快，待植株自然高度達到6 cm以上煉苗移栽，成苗率為100%。因此，無菌播種縮短了發芽和生根長葉時間，經后期煉苗移栽成活率高達100%，有利于萱草屬植物種子的快速繁殖。

在種子萌發試驗中，僅對種子進行簡單的蒸餾水浸泡預處理，結果發現，種子的污染率高達90%以上且發芽率很低，在排除種子質量、環境等問題造成的污染率較高、萌發率較低的基礎上，對種子進行熱水浸泡、高錳酸鉀浸泡、剝皮等處理，結果發現，污染率降低，發芽率提高。對于種子無菌發芽，預處理除菌方式很多。張文蓮等[16]通過萱草種子無菌培養研究其快繁技術的試驗中，采用0.3%高錳酸鉀溶液對萱草種子浸泡30 min進行消毒，本試驗借鑒此消毒方法；徐永清等[17]采用70℃干熱處理，48 h冷卻后沖洗的方法對月見草種子進行除菌，結果表明，種子經干熱處理后污染率由原來的85%降低到12.5%，因此，干熱處理可以起到除菌作用。

本試驗采用蒸餾水浸泡24 h后剝去黑色革質外種皮和茸毛狀內種皮，露出白色胚乳的種子接種到培養基上，污染率最低，為6%，萌發率最高，為80%；剝去種皮種子的萌發率顯著高于未剝去種皮種子的萌發率，且剝去種皮后種子萌發較快而且整齊，這與周曉杰等[18]在百合遠緣雜交種子快繁方法中的研究結果一致。張日清等[19]對櫸樹種子進行剝殼預處理后，種子萌動時間由60 d縮短到10 d。

對于萱草種子形狀不規則，外種皮革質，致密光滑，內種皮茸毛狀，不剝皮消毒污染率極高，剝去外種皮和內種皮，再進行消毒處理能顯著降低污染率，可能是由種子內部有真菌感染所導致的。70%酒精＋0.1%升汞消毒處理，污染率最低，為6%～12%，但隨著消毒時間的延長，種子的萌發率隨之降低，可能是HgCl2有很強的毒性，經過HgCl2消毒處理后，HgCl2直接與種子的胚乳接觸而將種子殺死，導致其最終發芽率降低[20]。

常用的外植體消毒劑有70%～75%酒精，2%～10%NaClO，0.1%～1%的HgCl2[21]。本試驗使用單一消毒劑和2種消毒劑結合使用，其中，70%酒精30 s＋0.1%HgCl2結合使用的消毒效果最佳，其中，70%酒精30 s＋0.1%HgCl210 min，污染率降低到了6%。還可以對污染的種子進行二次消毒，以再次降低污染率。趙玉芬等[15]研究了大花萱草雜交種子試管內萌發情況，結果發現，對污染的種子重新消毒可降低污染率。

組培苗的煉苗移栽，盡管植株自然生長高度在3 cm以上的成活率達到75%～100%，移栽后植株葉片生長較快，但葉片發黃卷曲，植株整體纖細瘦弱，長勢較弱。種子得到的苗子基本無須根，根量很少且根較長，導致煉苗時整體長勢較弱。本試驗對此研究不夠深入，今后可在培養基中添加激素誘發更多根系，同時選擇可誘發根系的栽培基質進行栽培，以得到粗壯、長勢較強的植株。

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Study on the Aseptic Seeding ofHemerocallis citrinaBaroni

CHUHuanning，HOUFeifan，JIAYan，LI Fangfang，LI Xiaolin，LI Sen，KANGXiuping，XINGGuoming
（College ofHorticulture，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Hemerocallis citrina Baroni have both edible,ornamental and medicinal values.To improve the speed of propagation of filial generation,the paper inoculated the Hemerocallis citrina Baroni seeds on MS culture medium after being pretreated and degermed with different methods,calculated the contamination rate and germination rate 7 days later and established the best suitable acclimatization system according to different physiological stages of seedlings.The results showed that the pretreatment of husking the black epidermis and the trichome internal epidermis to show the white endosperm after being soaked for 24 hours had the lowest contamination rate（6%）and the highest germination rate（80%）.The degerming effect of70%ethanol（30 s）＋0.1%HgCl2（5,10 min）on the surface of seeds had the lower contamination rate,which were 8%and 6%,respectively,but the germination rate of 0.1%HgCl210 min was lower than 5 min.The survival ratio was 100%of the plantlets with the plant natural height above 6 cm.This resech would provide basis for the rapid propagation ofthe Hemerocallis L.filial generation.

Hemerocallis citrina Baroni;seeds;aseptic seeding;seedling;acclimatization

S644.3

A

1002-2481（2017）04-0587-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.04.24

2017-01-11

山西省回國留學人員科研資助項目（2015-065）；高等學校博士學科點專項科研基金項目（20131403110005）

褚煥寧（1991-），女，河北石家莊人，在讀碩士，研究方向：花卉栽培與生理。亢秀萍為通信作者。