肺癌與HPV感染相關性的初步研究

姚 麗，鞏 麗，朱少君，韓秀娟，蘭 淼，張 偉 （第四軍醫大學唐都醫院病理科，陜西西安710038）

·檢驗與轉化醫學·

肺癌與HPV感染相關性的初步研究

姚 麗，鞏 麗，朱少君，韓秀娟，蘭 淼，張 偉 （第四軍醫大學唐都醫院病理科，陜西西安710038）

目的：應用液相芯片技術分析肺癌患者與HPV感染的相關性．方法：重組質粒表達HPV16 E6和E7蛋白，同微球偶聯后作為抗原，應用Luminex系統檢測肺癌患者血清中的相應抗體．結果：肺癌組HPV16 E6／E7抗體水平顯著高于正常對照組，肺鱗狀細胞癌與腺癌腫瘤組對比，肺鱗狀細胞癌HPV16 E6／E7抗體陽性率顯著高于肺腺癌組，差異具有統計學意義（P＜0．05）．結論：HPV感染與肺鱗狀細胞癌具有一定的相關性，為進一步研究肺鱗狀細胞癌發生的分子機制提供了依據．

肺癌；HPV；液相芯片

0 引言

肺癌從組織學上分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌［1］，而非小細胞肺癌主要包括鱗狀細胞癌和腺癌．人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）病毒為DNA病毒，通常感染人體特定部位的皮膚和粘膜的基底細胞．根據其與人類腫瘤的關系，HPV可分為高危型（HPV16，HPV18，HPV31，HPV33，HPV35）、中危型（HPV31，HPV33，HPV35）和低危型（HPV6，HPV11）［2－3］．眾所周知 HPV感染可以導致宮頸癌，HPV感染與陰道、肛門和陰莖癌等外陰部癌癥的發生存在明顯的相關性［4］．本研究應用高通量的Luminex 100 液相芯片技術檢測肺癌與HPV病毒感染的關系以及相關的HPV類型，為肺癌的預測及預防提供理論基礎及臨床方法，現報道如下．

1 材料和方法

1．1 實驗標本患者血清標本選自唐都醫院，經臨床及病理診斷為肺癌的患者82例，正常對照血清選自健康獻血者67例．

1．2 主要試劑酪蛋白及谷胱甘肽購自sigma公司，蛋白酶抑制劑購自Roche公司，CBSK及濾膜板均購自millipore公司，鏈霉素標記的藻紅蛋白購自Invitrogen公司，其他試劑均為進口分析純．pGEX?HPV16?tag質粒由本實驗室保存．

1．3 方法

1．3．1 高度危險型HPV16 E6和E7蛋白表達 質粒pGEX?GST?HPV16 E6／E7?tag電轉化 E．coli BL21（DE3），挑單克隆的菌落，在含有氨芐霉素的5 mL LB中37℃震蕩培養12 h，然后接種于60 mL LB中，37℃震蕩過夜，加入 350 mL LB，當室溫培養至OD600＝0．5時，加IPTG誘導劑誘導蛋白表達6 h，離心收集菌體，重懸于PBS，超聲裂解，14000 rpm離心，收集上清液．用Bradford法測量蛋白濃度．

1．3．2 G?C微球包被HPV16 E6／E7蛋白及純化1 mg／mL含GST?HPV16 E6／E7?tag蛋白的菌體裂解液加適量的G?C微球，室溫避光搖床孵育1 h，阻斷緩沖液洗滌3次，其他的菌液雜蛋白由于不含有GST蛋白無法與G?C微球結合，故通過洗滌過程被清除，加適量阻斷緩沖液重懸．

1．3．3 血清檢測 血清1∶50孵育于阻斷緩沖液，室溫1 h．濾膜96孔板加50 μL HPV16 E6／E7蛋白包被的G?C微球和50 μL孵育后的血清，室溫1 h，真空泵阻斷緩沖液洗滌3次，1∶1000生物素標記的羊抗人IgG100 μL，室溫1 h，洗滌3次，1∶1000鏈霉素標記的藻紅蛋白100 μL，室溫1 h，洗滌3次，100 μL阻斷緩沖液重懸，Luminex系統檢測MFI．

1．4 統計學處理采用SPSS17．0統計學軟件進行數據分析，行t檢驗，P＜0．05表示差異有統計學意義．

2 結果

2．1 應用Luminex系統檢測肺癌患者及正常對照血清中HPV16 E6／E7抗體Luminex系統檢測的優點在于不同的微球具有不同的光譜，能夠被單獨識別，故本次實驗應用兩種微球分別包被兩種HPV抗原（HPV16 E6和E7蛋白），置于1個反應體系中同時檢測1份血清中的HPV16的兩種抗體．結果顯示，肺癌組HPV16 E6／E7抗體水平顯著高于正常對照組（圖1）．

圖1 肺癌患者及正常對照血清中HPV16抗體檢測結果

2．2 應用Luminex系統檢測肺鱗狀細胞癌及肺腺癌患者血清中HPV16 E6／E7抗體選取肺癌患者82例作為研究對象，其中肺鱗狀細胞癌患者50例，肺腺癌患者32例，通過Luminex系統檢測肺鱗狀細胞癌及肺腺癌患者血清中HPV16 E6／E7抗體，結果顯示，肺鱗狀細胞癌患者血清中HPV16 E6／E7抗體陽性率顯著高于肺腺癌組，差異具有統計學意義（P＜0．05）．

表1 肺鱗狀細胞癌及肺腺癌患者血清中HPV16抗體水平檢測

3 討論

1979年，Syrj?nen［5］首次在肺癌中觀察到 HPV感染病灶的形態學改變．隨后，不同的研究機構應用不同方法檢測肺癌組織中是否含有HPV DNA，如斑點印記、原位雜交、Sourthern bolt及PCR法［6－7］．但由于方法的不同及實驗室之間的差異，不同的個案報道中，HPV DNA的檢出率相差很大［8］．肺癌從組織學上分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌［9］，而非小細胞肺癌又包括鱗狀細胞癌和腺癌［10］．肺鱗狀細胞癌通常的發病模式為在各種因素作用下支氣管的纖毛柱狀上皮鱗狀上皮化生，然后經過不同階段的不典型增生，最后癌變形成鱗狀細胞癌［11－12］．這個過程同HPV易感染宮頸的鱗柱交界處有相似之處．HPV病毒含有兩個主控轉化過程的原癌基因：E6和E7［13］，其蛋白的抗體在健康人群中少有發現，只同浸潤性癌高度相關，具有很好的特異性和敏感性，這可能是因為在初次感染和隱性感染中HPV病毒E6和E7蛋白表達的量少或未接觸到免疫系統［3，14］．

本研究應用高通量Luminex系統檢測肺癌患者血清中的HPV16抗體，結果顯示，與正常健康人群血清相比，肺癌患者血清中HPV16抗體水平明顯增高，并且肺鱗狀細胞癌患者血清HPV16抗體陽性率高于腺癌患者，這提示HPV可能參與肺鱗狀細胞癌的癌變過程，為肺鱗狀細胞癌的預防、診斷和治療提供了新的思路和靶點．

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Primary study on the correlation between lung cancer and HPV infection

YAO Li，GONG Li，ZHU Shao?Jun，HAN Xiu?Juan，LAN Miao，ZHANG Wei
Department of Pathology，Tangdu Hospital，Fourth Military Medi?cal University，Xi'an 710038，China

AIM：To analyze the correlation between lung cancer and HPV infection by Luminex technology．METHODS：HPV16 E6／E7 proteins binding to microparticle were expressed with recombinant plasmid．The corresponding antibodies in serum of patient with lung cancer were detected by Luminex technology．RESULTS：The level of HPV16 E6／E7 antibodies in lung cancer group were significantly higher than those of normal control group，and the difference was statistically significant（P＜0．05）．The antibody positive rate of HPV16 E6／E7 in squamous cell carcinoma of lung group was significantly higher than that of adenocarcinoma group，and the difference was statistically significant（P＜0．05）．CON?CLUSION：There was a correlation between HPV infection and lung squamous cell carcinoma，which will be helpful for the further study of molecular mechanism of lung squamous cell carcinoma．

lung cancer；HPV；liquichip

R734．2

A

2095?6894（2017）02?46?02

2016－11－25；接受日期：2016－12－10

陜西省自然科學基礎研究計劃項目（2013JQ4039）

姚 麗．博士，主治醫師．研究方向：腫瘤分子病理學．Tel：029?84777744 E?mail：yaoli＠fmmu．edu．cn

張 偉．主任醫師，教授．E?mail：zhangyi＠fmmu．edu．cn